一种新的CAF群体协调高度抑制性调节性T细胞在肺癌中的募集和定位

《Nature Immunology》：A novel CAF population coordinates hyper-suppressive regulatory T cell recruitment and localization in lung cancer

　　

在许多实体肿瘤类型中，癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）丰富且异质，不同亚群发挥免疫调节功能。在这里，研究人员在原发性肺腺癌和肺转移灶中鉴定到一种新的免疫调节性CAFs（immunomodulatory CAFs，imCAFs）群体，其特征是细胞黏附分子L1样（cell adhesion molecule L1-like，CHL1）表达，并富集于免疫调节和趋化因子信号通路。通过单细胞和空间转录组学，研究人员证明imCAFs与CXCR3⁺调节性T细胞（regulatory T cells，Treg cells）空间共定位，后者是一个高度抑制性亚群，聚集在肿瘤边缘。imCAFs产生CXCL9，驱动CXCR3⁺ Treg细胞募集，并促进免疫抑制微环境。CXCR3⁺ Treg细胞表现出增强的增殖和抑制能力，并且在转录水平上与CXCR3^?对应物不同。在Treg细胞中基因敲除Cxcr3或在基质细胞中敲除Cxcl9可减少Treg细胞积累，增强CD8⁺ T细胞活化并减少肿瘤负荷。人类非小细胞肺癌中类似的CHL1⁺ imCAF样成纤维细胞与Treg细胞共定位，且CHL1高表达与细胞毒性降低和无进展生存期缩短相关，突出了imCAF–CXCL9–CXCR3⁺ Treg轴作为有前景的治疗靶点。

**论文解读：肺癌中新型CAF群体通过CXCL9–CXCR3轴协调高度抑制性Treg细胞募集与定位**

**研究背景与问题**
肿瘤微环境（TME）是一个高度复杂的多细胞网络，其组分间的相互作用决定肿瘤进展及治疗反应。癌症相关成纤维细胞（CAFs）是TME中丰富且异质的关键基质细胞，不同亚群在肿瘤进展、细胞外基质重塑和免疫调控中发挥专门作用。其中，免疫交互性CAFs在多种恶性肿瘤中被证实可调节淋巴细胞的活化、募集与滞留，并成为预后标志物。然而，在肺腺癌（LUAD）等实体瘤中，CAF亚型及其对免疫协调的影响仍不明确。调节性T细胞（Treg cells）通过抑制抗肿瘤免疫在肿瘤进展中起关键作用，近期研究提示特定CAF亚群可通过趋化因子信号和受体-配体相互作用影响Treg细胞在TME中的动态，但LUAD中CAF亚群调控Treg细胞的具体机制尚不清楚。因此，研究人员旨在鉴定肺肿瘤中新的CAF亚群并阐明其调控Treg细胞的作用机制。

**研究内容与结论**
研究人员在原发性肺腺癌和肺转移灶中鉴定到一种新型免疫调节性CAFs（imCAFs），其标志性表达细胞黏附分子L1样（CHL1）。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学，发现imCAFs与CXCR3⁺ Treg细胞在肿瘤边缘空间共定位。imCAFs通过分泌CXCL9，经CXCR3受体驱动高度抑制性CXCR3⁺ Treg细胞的募集，促进免疫抑制微环境。CXCR3⁺ Treg细胞表现出增强的增殖和抑制能力，且转录组特征与CXCR3^? Treg细胞显著不同。遗传学实验表明，在Treg细胞中敲除Cxcr3或在基质细胞中敲除Cxcl9可减少Treg细胞积累，增强CD8⁺ T细胞活化并降低肿瘤负荷。人类非小细胞肺癌（NSCLC）中也存在类似的CHL1⁺ imCAF样成纤维细胞，与Treg细胞共定位，且CHL1高表达与细胞毒性降低和无进展生存期缩短相关。该研究于《Nature Immunology》发表，揭示了imCAF–CXCL9–CXCR3⁺ Treg轴作为肺癌免疫治疗新靶点的重要性。

**主要技术方法**
1. **单细胞RNA测序（scRNA-seq）**：对LLC^GFP肿瘤小鼠肺组织中分选的PDGFRα⁺成纤维细胞及全肿瘤肺匀浆进行scRNA-seq，鉴定成纤维细胞亚群。
2. **空间转录组学**：利用10x Visium平台对肿瘤肺切片进行空间转录组分析，结合cell2location模型进行细胞类型空间定位。
3. **免疫荧光显微镜**：对小鼠和人类肺肿瘤组织进行CHL1、FOXP3、CXCL9等多色染色，并通过k-means最近邻分析量化细胞间距离。
4. **流式细胞术与细胞分选**：分析T细胞亚群表面标志物，分选CXCR3^?和CXCR3⁺ Treg细胞进行体外抑制实验和RNA-seq。
5. **竞争性Transwell迁移实验**：评估肿瘤来源T细胞对CXCL9和CXCL10梯度的趋化响应。
6. **混合骨髓嵌合体实验**：利用Cxcr3^KO/KO和Cxcl9^KO/KO小鼠构建嵌合体，评估Treg细胞特异性CXCR3或基质CXCL9的作用。
7. **公共数据库分析**：利用人类NSCLC单细胞图谱（43例患者）和TCGA-LUAD数据集（PanCanAtlas）进行生信分析。
（样本队列来源：小鼠模型包括LLC^GFP、KP、KcP、B16F10、KPCy；人类样本来自哥伦比亚大学医学中心数据库及TCGA。）

**研究结果**
**imCAFs在肺肿瘤组织中富集**
通过scRNA-seq，研究人员在LLC^GFP肿瘤肺中鉴定出7个成纤维细胞簇，其中Chl1⁺簇（87.8% ± 6.7%来源于肿瘤组织）高表达免疫调节基因（Timp1、Cxcl9、Cxcl10等），REACTOME分析提示其与适应性免疫系统相互作用，命名为imCAFs。免疫荧光证实CHL1⁺ imCAFs主要位于肿瘤边缘，与经典myCAF标志物（Tn-C、αSMA）重叠少，且在KP和KcP自发LUAD模型中也存在。

**imCAFs指导Treg细胞在肺肿瘤中的定位**
空间转录组学cell2location分析显示imCAFs与T细胞在肿瘤周围区域共定位，其中Treg细胞与imCAFs的空间交叉相关指数（SCI）最高。免疫荧光k-means最近邻分析证实，与Tconv和CD8⁺ T细胞相比，Treg细胞更靠近CHL1⁺ imCAFs。肿瘤Treg细胞表现出更强的增殖和免疫抑制标志物表达。

**imCAF来源的CXCL9驱动Treg细胞募集至肺TME**
scRNA-seq显示imCAFs是Cxcl9的最主要表达者，RT-qPCR证实CHL1⁺ imCAFs中Cxcl9表达高于CHL1^? CAFs。免疫荧光共定位显示Treg细胞优先靠近CXCL9⁺CHL1⁺ imCAFs，且CXCL9⁺ imCAFs数量与Treg细胞数量正相关。竞争性Transwell实验表明，肿瘤来源Treg细胞对CXCL9梯度的迁移能力显著强于其他T细胞亚群及正常组织Treg细胞，而CXCL10无此偏好性。在B16F10和KPCy肺转移模型中，imCAFs也存在于转移灶，但仅在KPCy模型中imCAFs表达Cxcl9并介导Treg细胞共定位。

**CXCR3识别高度抑制性Treg细胞亚群**
流式细胞术显示，肿瘤Treg细胞中CXCR3表达水平最高，且CXCR3⁺ Treg细胞高表达活化（CD69）、增殖（Ki67）和免疫抑制（CTLA-4、PD-1、GITR）标志物。体外抑制实验表明，CXCR3⁺ Treg细胞比CXCR3^? Treg细胞更有效地抑制naive Tconv细胞增殖。Bulk RNA-seq显示CXCR3⁺ Treg细胞转录组与CXCR3^? Treg细胞显著不同，富集免疫抑制基因（Il10、Tgfb1、Entpd1）和效应基因（Irf4、Tigit、Ebi3）。

**CXCR3缺失限制Treg细胞运输和肿瘤生长**
混合骨髓嵌合体实验中，Cxcr3^KO/KO Treg细胞在肿瘤中的比例显著低于Cxcr3^WT/WT Treg细胞，且在Cxcr3^KO/KO Treg细胞中增殖和免疫抑制标志物表达降低。利用Cxcr3^KO和Foxp3^KO骨髓以1:10比例构建嵌合体（使所有Treg细胞来源于Cxcr3^KO），结果显示缺乏CXCR3表达Treg细胞的小鼠肿瘤负荷显著降低，Treg细胞数量减少，CD8⁺ T细胞增殖比例升高。但CXCR3缺失不影响Treg细胞在TME中靠近imCAFs的局部定位，提示CXCR3主要驱动迁移而非滞留。

**基质Cxcl9驱动Treg细胞迁移和肿瘤生长**
通过Cxcl9^KO/KO小鼠的骨髓移植实验，缺失基质来源（而非造血来源）的Cxcl9显著降低肿瘤负荷、减少Treg细胞积累，并降低CXCR3⁺ Treg细胞比例。相比之下，Cxcl10缺失对肿瘤生长和Treg细胞数量无显著影响。这些结果表明，CAF来源的CXCL9在招募CXCR3⁺ Treg细胞至TME中起主导作用。

**人类NSCLC imCAF样成纤维细胞预测不良生存**
利用人类NSCLC单细胞图谱，研究人员鉴定出与小鼠imCAF转录组高度相似的CHL1⁺ CAF簇，该簇高表达CHL1、CXCL9和CXCL10。TCGA-LUAD分析显示，CHL1高表达患者无进展生存期显著缩短，且CAF富集评分更高、细胞毒性评分更低。免疫组化染色证实人类LUAD组织中CHL1⁺成纤维细胞与FOXP3⁺ Treg细胞空间共定位（5/6例患者）。

**总结与讨论**
本研究首次在肺肿瘤中鉴定出imCAF亚群，并揭示其通过CXCL9–CXCR3轴招募高度抑制性CXCR3⁺ Treg细胞的新机制，证实基质细胞可主动组织免疫抑制性T细胞回路。CHL1被确立为鉴定LUAD高度免疫抑制TME的新型生物标志物。该imCAF–CXCL9–CXCR3⁺ Treg轴在肺转移模型中也保守存在，拓宽了治疗相关性的范围。研究还发现，imCAF衍生的CXCL9利用了次级淋巴器官中成纤维网状细胞组织T细胞的空间逻辑，但在肿瘤中被劫持用于免疫逃逸。与皮下肿瘤模型不同，原位肺肿瘤模型中CAF来源的CXCL9是驱动Treg细胞募集的关键来源，而非树突状细胞。此外，CXCR3缺失不影响Treg细胞在imCAF附近的局部滞留，提示存在独立的滞留信号。靶向该轴（而非全局性Treg细胞清除）有望改善抗肿瘤免疫并减少全身毒性。

**研究结论翻译**
人类非小细胞肺癌中类似的CHL1⁺ imCAF样成纤维细胞与Treg细胞共定位，且CHL1高表达与细胞毒性降低和无进展生存期缩短相关，突出了imCAF–CXCL9–CXCR3⁺ Treg轴作为有前景的治疗靶点。