细胞RNA稳态丧失有助于病毒感染期间MDA5的激活

《Nature Immunology》：Loss of cellular RNA homeostasis contributes to MDA5 activation during virus infection

　　

MDA5是一种先天免疫RNA传感器，能够感知多种病毒和其他病原体的感染。MDA5的RNA激动剂尚未被明确界定。在此，研究人员利用单核苷酸分辨率交联和免疫沉淀（iCLIP）技术研究其配体。值得注意的是，在感染SARS-CoV-2或脑心肌炎病毒后，MDA5主要结合细胞RNA。许多结合位点位于内含子中，且邻近Alu元件和潜在碱基配对结构。同时，感染细胞中异常转录本和含内含子的未剪接转录本的细胞质水平升高，并显示出MDA5 iCLIP峰值的富集。此外，过表达剪接因子SRSF3可减少异常转录并消除MDA5激活。综上所述，研究人员提出MDA5监视RNA加工保真度，并可通过感知剪接等转录后事件的扰动来检测感染。

细胞RNA稳态监视：MDA5感知病毒感染的机制解读

MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白5）是维甲酸诱导基因I样受体（RLR）家族中的关键RNA传感器，在先天免疫中负责识别病毒核酸并诱导I型干扰素（T1-IFN）应答。尽管MDA5被发现已超过20年，其在感染过程中真正识别的RNA配体始终存在争议，导致MDA5成为少数仍未明确PAMP（病原体相关分子模式）的“孤儿”模式识别受体。传统观点认为，MDA5在病毒感染时识别复制中间体形成的长双链RNA（dsRNA），但这一模型无法解释为何MDA5能感知多种不同类型的病毒，包括DNA病毒和逆转录病毒，也无法解释病毒dsRNA被病毒蛋白或复制工厂隔离时免疫激活如何发生。因此，阐明MDA5在感染中实际结合的RNA种类及其激活机制，对于理解先天免疫应答和开发抗病毒治疗策略具有重要意义。

研究人员采用内源性MDA5双免疫沉淀（dual IP）结合单核苷酸分辨率交联和免疫沉淀（iCLIP）技术，在两种病毒模型——脑心肌炎病毒（EMCV）和SARS-CoV-2——感染的人类细胞中，对MDA5结合的RNA进行了全基因组水平的鉴定。结果显示，MDA5在感染过程中并非主要结合病毒RNA，而是压倒性地结合宿主来源的细胞RNA。这些宿主RNA结合位点大部分位于内含子区域，并显著富集于Alu元件和潜在碱基配对结构附近。进一步分析发现，病毒感染导致细胞质中异常转录本和含内含子的未剪接RNA水平显著上升，且这些RNA与MDA5 iCLIP结合位点正相关。当过表达剪接因子SRSF3以恢复RNA稳态时，异常转录本减少，MDA5激活被取消，而病毒复制不受影响。该研究发表于《Nature Immunology》，提出MDA5实质上监测细胞RNA加工保真度，通过感知剪接等转录后事件紊乱来“守卫”细胞状态，从而识别病毒感染。

在技术方法上，研究人员主要使用了以下关键手段：首先，开发了针对内源性MDA5的单克隆抗体并建立双免疫沉淀流程，实现对MDA5-RNA复合物的高严格度纯化；其次，采用iCLIP技术，以单核苷酸分辨率鉴定MDA5在活细胞中的RNA结合位点；再次，利用RNA测序和生物信息学分析（包括PureCLIP、HOMER、MEME-ChIP等）对结合位点进行基因组定位和基序分析；此外，通过体外转录合成候选RNA并进行细胞转染实验验证其MDA5激活能力；最后，使用细胞质RNA测序和剪接分析工具（如IRFinder、index）评估病毒感染对RNA加工的影响。样本包括THP1单核细胞和Calu-3肺上皮细胞，分别感染EMCV和SARS-CoV-2。

主要研究结果如下：

**双免疫沉淀分离内源性MDA5结合的RNA**
研究人员筛选了表达内源性MDA5的THP1细胞系，利用CRISPR/Cas9技术生成MDA5敲除对照，并开发了两种单克隆抗体（抗体A识别天然MDA5，抗体B识别变性MDA5）。通过顺序免疫沉淀，成功从细胞裂解物中特异分离出MDA5-RNA复合物，为后续iCLIP奠定了方法学基础。

**EMCV感染期间MDA5结合宿主RNA**
对EMCV感染的THP1细胞进行iCLIP测序，发现超过99%的MDA5结合RNA来自人类基因组而非病毒基因组。结合位点主要分布在内含子区域，约35%位于重复序列中，其中Alu元件显著富集。同时，MDA5结合序列中富集Poly(A)和Poly(U)基序，以及GGUU/AACC基序，提示这些基序可能参与RNA结构识别。

**合成宿主RNA在细胞中激活MDA5**
选取MDA5结合位点所在基因组区域，通过体外转录合成约500核苷酸长的RNA，退火形成dsRNA后转染RIG-I敲除的细胞。结果显示，部分宿主RNA区域能以MDA5依赖性方式激活IFNB1启动子和干扰素刺激基因表达，且含有重复序列的区域（如LINE1、MIR）刺激活性更强。这验证了宿主RNA本身具备激活MDA5的能力。

**SARS-CoV-2感染期间MDA5结合细胞RNA**
在SARS-CoV-2感染的Calu-3细胞中重复了iCLIP实验。同样，MDA5主要结合宿主RNA，而非病毒RNA。结合位点约50%位于内含子，约30%位于重复序列，且约50%的101-nt结合区域与Alu元件重叠。序列分析再次发现Poly(A)/(U)基序富集，并观察到部分结合位点可能对应MDA5在dsRNA上14–15 nt足迹的两个边缘。

**病毒感染增加细胞质中异常RNA**
通过细胞质RNA测序，发现EMCV和SARS-CoV-2感染均显著诱导异常转录事件，包括内含子转录、基因下游和上游转录、以及通读转录。而IFNβ处理仅引起极少量异常。使用IRFinder和index分析进一步表明，病毒感染导致细胞质内含子保留和未剪接前体mRNA水平升高，且这些上调的内含子与iCLIP检测到的MDA5结合内含子显著重叠。MDA5结合的内含子倾向于位于基因的第一个内含子，长度更长，剪接位点和分支点序列较弱，提示这些内含子本身易发生剪接缺陷。

**减少异常转录本消除MDA5激活**
在LIM1215细胞中稳定过表达剪接因子SRSF3-GFP，可显著降低EMCV感染诱导的异常转录。在病毒滴度不引起细胞死亡的条件下，SRSF3过表达抑制了EMCV诱导的I型干扰素应答，但对甲型流感病毒（经RIG-I感知）和Poly(I:C)（直接激活MDA5）的应答无影响，且病毒RNA水平未降低。这表明SRSF3通过恢复RNA稳态特异性抑制MDA5激活，进一步支持MDA5感知宿主RNA加工紊乱的模型。

讨论部分指出，MDA5的激活机制更类似于“守卫”而非经典的PAMP识别，即检测病原体引起的宿主扰动。该机制可解释MDA5广谱感知多种病毒和病原体的能力，也解释了病毒dsRNA被隔离时仍能触发免疫。研究还联系到ADAR1突变导致的Aicardi–Goutières综合征、剪接抑制剂在癌症治疗中激活干扰素等平行证据，提示异常RNA加工感知是感染和无菌炎症中MDA5激活的通用机制。此外，该研究提供的MDA5抗体和iCLIP方案可作为开放资源，用于自身炎症和癌症治疗中MDA5激动剂的发现。

研究结论强调，MDA5并不单纯作为病毒dsRNA的PAMP传感器，而是能够监视细胞RNA稳态。病毒感染扰动RNA加工时，未正确加工的细胞RNA（如含内含子的转录本）在细胞质积累，从而激活MDA5。这一发现对涉及MDA5激活的感染性和非感染性疾病治疗策略具有重要影响。