SCDM-net：基于SERS的肺癌外泌体分析中的共生因果去偏方法

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：SCDM-net: Symbiotic causal debiasing for SERS-based exosome profiling in lung Cancer

　　

摘要

早期发现肺癌有助于改善患者的预后。通过表面增强拉曼散射技术对外泌体进行分析，可为肺癌相关的分子特征分析提供方法；然而，仪器差异和批次差异可能会掩盖与疾病类别相关的光谱特征。为解决这一问题，我们开发了一种共生因果去偏多尺度网络。该网络中的“共生-寄生”模块利用门控残差融合机制来模拟与偏差相关的表征和与疾病类别相关的表征之间的相互作用。双流架构则分别处理原始的一维光谱以及二维短时傅里叶变换谱，通过多尺度卷积来捕捉指纹区域以及与脂质和蛋白质相关的区域的互补光谱特征。梯度反转层则有助于区分与疾病类别相关的表征和与批次相关的表征。在使用来自12个独立生物批次的4006份外泌体SERS光谱进行测试时，SCDM-Net在未用于训练的4个生物批次构成的测试集上取得了90.77%的准确率和0.8980的F1值。这些基于细胞系来源外泌体的概念验证结果为基于SERS的外泌体分析在肺癌研究中的应用提供了方法框架，而要实现临床应用还需通过患者来源的样本进行验证。

引言

肺癌仍是全球最常诊断出的癌症类型之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因之一[1]。如果在疾病早期而非晚期被发现，患者的生存率会显著提高[2]、[3]。组织活检具有侵入性，空间代表性有限，且不适于反复监测肿瘤的异质性[4]。而液体活检则是一种微创替代方案，能够实现多次采样，还能反映全身性的肿瘤负荷[5]。

外泌体是直径为40–160纳米的脂质双层囊泡，由细胞释放后存在于血液、尿液及其他体液中[6]、[7]。由于其稳定性以及能够携带蛋白质、核酸和脂质等物质，外泌体有望成为出色的液体活检生物标志物[8]。肺癌相关的外泌体可携带表皮生长因子受体、CA125以及与疾病相关的微RNA等分子特征[9]、[10]。不过，由于这些外泌体的生物标志物特征尚未完全明确[11]、[12]，其分子组成也存在异质性[13]，而且体液中的肿瘤来源囊泡数量可能较少[14]，因此其临床应用仍面临诸多挑战。包括酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应、表面等离子体共振以及光流体免疫芯片在内的传统检测方法通常依赖于预先定义的检测目标[15]、[16]、[17]，可能无法全面反映复杂样本中外泌体的整体分子特征。

表面增强拉曼散射技术无需标记即可实现多重分子特征分析，具备强大的信号放大能力，且受水的影响较小，因此非常适合用于外泌体分析[18]、[19]、[20]。该技术已可用于无标记地分析与肺癌相关的外泌体[21]、[22]，而自主式微激光系统则为细胞外囊泡的分析提供了另一种光学方法[23]。然而，SERS光谱中存在重叠峰、背景波动以及高维非线性模式，这些特点使得传统的化学计量学方法如主成分分析难以对其进行有效解析[24]。因此，需要采用更强大的学习方法，才能在不依赖人工特征工程的情况下，从单个光谱中提取出与疾病类别相关的细微信息。

深度学习能够学习分层的光谱特征，越来越多地被应用于拉曼/SERS生物医学分析领域[19]、[25]、[26]。除了这些计算技术的进步之外，近期出现的基于二维纳米材料的生物传感器也体现了在肺癌光学检测方面的持续发展[27]。卷积神经网络，如AlexNet和ResNet，已经证明了分层特征学习的重要性[28]、[29]，随后也被应用于与疾病相关的拉曼分析中[30]。在外泌体相关光谱分类研究中，Shin等人将经过主成分分析简化后的SERS特征与ResNet结合用于肺癌外泌体分析[21]，Xie等人则将视觉Transformer应用于经过主成分分析简化后的外泌体SERS谱图分析[31]，还有某种名为Exosome-SERS-AI的平台则利用全连接网络来区分不同类型的癌症[22]。不过，这些方法往往依赖于降维处理后的数据或单一类型的特征输入，且通常不会明确区分与疾病类别相关的信号和与批次相关的变异。二维变换则可以提供互补的特征表示：Qi等人使用基于短时傅里叶变换的拉曼光谱图进行CNN分类[32]，而Zhao等人则使用基于连续小波变换的光谱图来进行高光谱分析[33]。正是鉴于这些局限性，我们开发了一种双流框架，该框架既能保留原始的一维光谱，又能学习基于短时傅里叶变换的互补特征表示，同时还通过因果去偏机制来减少与批次相关的变异。本研究通过细胞系来源的外泌体进行了概念验证，而在实际临床应用之前，还必须在患者来源的样本中进行进一步验证。

章节节选

样本收集

该数据集包含了从细胞培养上清液中分离得到的4006份经过质量控制的SERS光谱：其中1496份来自A549肺癌细胞，2510份来自BEAS-2B正常支气管上皮细胞。

这两种细胞系均在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的高糖Dulbecco改良Eagle培养基中培养，培养温度为37摄氏度，培养环境为5%二氧化碳浓度。培养液先在300×g的条件下离心10分钟，然后再在2000×g的条件下继续离心

数据集准备及外泌体特征分析

在对4006份外泌体SERS光谱进行质量控制后，我们评估了所提出模型的性能优势及其各模块的有效性。这些数据来自12个独立的生物批次（A549和BEAS-2B两种细胞系各6个批次）。数据分割是在生物批次层面进行的：随机选取4个完整的批次（每种细胞系2个）作为独立的测试集，其余8个批次则用于模型训练。这种基于批次层面的数据分割方式

讨论

SCDM-Net的设计旨在减少干扰因素的影响，同时保留基于SERS的外泌体分析中与疾病类别相关的信息。其“共生-寄生”动态门控机制能够模拟与偏差相关的表征和与疾病类别相关的表征之间的相互作用。消融实验结果表明，这一机制有助于保留具有区分度的光谱信息，同时降低不必要的干扰，从而提升当前数据集下特征的稳定性。

在ROC分析中，

结论

我们针对肺癌研究中的细胞系来源外泌体分析，开发了基于SERS的SCDM-Net分析框架。该框架结合了双流多尺度特征提取技术、互补的一维和二维光谱表示方法、共生门控模块以及基于梯度反转的对抗学习机制，用以实现与疾病类别相关的表征和与批次相关的表征的分离。在使用来自12个独立生物批次的4006份SERS光谱进行测试后，SCDM-Net取得了

利益冲突声明

作者们声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益或个人关系：Chao Bi表示其研究工作得到了浙江大学实验技术项目（SYBJS202527）的资助。其他作者则声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢杨世宽教授在本研究及其他相关研究期间给予的指导。本研究得到了浙江大学实验技术项目的资助（项目编号：SYBJS202527）。

Chao Bi|Shuangshuang Liu|Wei Yin|Yanwei Li|Xiaoli Hong|Yingniang Li|Ning An

中国浙江省杭州市浙江大学医学院核心实验室，邮编310058