缺氧通过HIF-2α刺激的E1A表达增强溶瘤腺病毒的活性

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Hypoxia increases the activity of oncolytic adenoviruses through HIF-2α-stimulated E1A expression

　　

缺氧是实体瘤的标志性特征，因与不良预后及常规治疗耐药相关，给癌症治疗带来重大挑战。溶瘤病毒是一种有前景的治疗策略，可在癌细胞内选择性复制并裂解细胞，潜在覆盖缺氧肿瘤区域。研究人员检测了缺氧条件如何影响enadenotucirev（EnAd，一种临床相关B组溶瘤腺病毒，既往在异种移植瘤缺氧区被检出）的活性。研究人员证实缺氧通过提升腺病毒即刻早期、早期和晚期基因的转录与翻译来增强病毒产量。即刻早期基因E1A在病毒进入后2小时内于缺氧下上调17倍，由启动子中保守的低氧反应元件（HRE）驱动。机制研究揭示缺氧诱导因子（HIF）-2α与HIF-1β异二聚体结合该HRE并反式激活E1A。通过诱导E1A表达，缺氧同时提升病毒基因组合成、结构蛋白产生及治疗性转基因表达，凸显EnAd靶向缺氧肿瘤微环境的潜力。这是首次报道人腺病毒中存在功能性HRE，该元件在59种腺病毒基因型中保守，并将缺氧确立为增强溶瘤活性的驱动因素，对实体瘤腺病毒疗法具启示意义。

研究背景与立项依据

缺氧是大多数实体瘤的定义性特征，可通过塑造基质与免疫细胞行为促进肿瘤进展，并与放疗、化疗及免疫治疗的耐药和不良临床结局相关。缺氧肿瘤区域因灌注差难以被传统药物抵达，而溶瘤病毒凭借选择性复制、诱导细胞裂解及细胞间传播，有望覆盖这一盲区。EnAd（enadenotucirev，前称ColoAd1）是通过定向进化构建的Ad11p/Ad3嵌合B组腺病毒，经静脉给药可感染远处瘤灶，但其于缺氧条件下的表现知之甚少。已有研究在DLD-1异种移植瘤缺氧区发现EnAd感染灶，且不同溶瘤病毒体外靶向缺氧细胞能力各异，但腺病毒于低氧下的生命周期调控机制尚未阐明。该研究旨在明确缺氧影响EnAd感染周期的哪些阶段，并揭示其分子机制，论文发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

主要关键技术方法

研究采用体内DLD-1结肠癌细胞系异种移植瘤模型（CB17-SCID小鼠，静脉注射EnAd-SA-fLuc报告病毒，哌莫硝唑标记缺氧核心）进行空间组织学分析；体外使用透气培养板维持恒定1% O₂缺氧与21% O₂常氧，对DLD-1、HCT116、HT-29、SK-OV-3、A549等癌细胞系行单步高感染复数（MOI≥3）同步感染；结合荧光素酶报告系统、qRT-PCR与qPCR绝对定量病毒mRNA及基因组、免疫印迹检测E1A-cFLAG等蛋白、染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）判定HIF占位、siRNA敲低HIF-2α/HIF-1β/HIF-1α及DAXX、双胸苷阻断细胞周期同步化、PHD抑制剂FG-4592药理模拟缺氧、VHL^?/? RKO细胞等多元验证。

研究结果

EnAd entry, infection kinetics, and virion production in hypoxic cells

体内空间分析显示hexon⁺病毒灶富集于缺氧核心（哌莫硝唑⁺）外周50 μm带；体外恒定缺氧下，DLD-1、HCT116、HT-29、SK-OV-3等细胞单轮感染释放感染颗粒增加4–14倍。缺氧不改变CD46表面表达、病毒附着与内化、感染周期时长（xCELLigence阻抗）、基因组封装率（benzonase处理）及子代毒粒蛋白组成（变性电泳），表明增益源于转录翻译而非进入或装配。

Viral immediate-early, early, late, and transgene expression under hypoxia

缺氧2小时即令E1A mRNA升至常氧17倍，8与12 hpi持续偏高；E1A-cFLAG蛋白在DLD-1、A549、SK-OV-3同样上调。下游E2B（编码DNA聚合酶）mRNA于5 hpi达30倍，伴随12 hpi基因组合成4.5倍增加。晚期Fiber mRNA 2 hpi即升，12 hpi达4倍，hexon/penton/fiber蛋白增加；MLP偶联的EpCAM/CD3双特异性T细胞衔接器（BiTE）分泌增15%，CMV启动子驱动BiTE仅微增。嘌呤霉素掺入显示缺氧本身抑制全局翻译30%，感染叠加进一步抑制，但病毒基因翻译仍被促进。

Induction of E1A expression in hypoxic cultures

DAXX在缺氧感染细胞偏胞质，常氧感染偏核；但siRNA敲低DAXX于两氧条件下均升E1A并提滴度（常氧52倍、缺氧118倍），且常氧敲低后仍未达缺氧水平，排除DAXX核定位主导。双胸苷阻断令细胞积于G1，G1阻滞于两氧条件均升E1A，但常氧G1阻滞未能复现缺氧E1A蛋白峰值，提示G1积累仅部分贡献。

Role of HIF in transactivation of E1A

FG-4592于常氧稳定HIF并令E1A升至缺氧水平。Ad11p的E1A启动子?187 bp处含保守ACGTG（R/CGTG）HRE，跨59株人腺病毒A–G种保守；MLP启动子?60 bp处同含ACGTG但无功能。荧光素酶报告示缺氧激活wtE1A启动子，ACGTG→ACATA突变体无响应；VHL^?/? RKO中wt启动子活1.8倍突变体无变。ChIP-qPCR示HIF-1α、HIF-2α、HIF-1β均富集于E1A HRE区。HCT116^wt及HIF-1α^?/?细胞中敲低HIF-2α或HIF-1β取消缺氧E1A诱导，单敲HIF-1α不影响；FG-4592下wt报告诱导亦被HIF-2α/1β敲低消除。SK-OV-3中敲低HIF-2α或HIF-1β令缺氧滴度降8倍。结论：HIF-2α/HIF-1β异二聚体直接反式激活E1A HRE。

讨论与结论翻译

研究人员讨论指出，缺氧通过HIF-2α/1β结合E1A启动子保守HRE提升即刻早期E1A转录，经正反馈放大早期E2B与晚期MLP驱动的结构蛋白及基因组合成，最终增大溶瘤腺病毒爆发量；该机制在B组EnAd与C组Ad5中均存在，HRE跨59株 Mastadenovirus 保守，为首个腺病毒功能性HRE报道。DAXX敲低大幅提产提示制造工艺新靶点；与既往认为缺氧抑制Ad5/E1A的报道差异源于透气板恒氧与同步高MOI设计，规避了长期培养代谢耗竭与干扰素信号。体内EnAd灶富集于非坏死低氧带，与其E1A氧敏转录一致，支持其跨越氧梯度治疗实体瘤。结论：缺氧经HIF-2α/HIF-1β依赖的E1A启动子激活正向增强溶瘤腺病毒产出，为低氧环境下B组腺病毒感染提供新机制解释。