综述：噬菌体展示作为多肽药物发现的有前景平台

《Pharmaceuticals》：Phage Display as a Promising Platform for Peptide Drug Discovery

　　

多肽在现代药物发现中日益受到欢迎，具有解决小分子和抗体无法满足的临床需求的潜力。通过提供“两全其美”的特性，多肽正成为靶向疾病相关挑战性蛋白的有力工具。组合肽库在多肽药物的开发中发挥了关键作用。噬菌体展示是制药探索中被最广泛采用的组合框架之一，在过去几十年中引领了多肽药物发现的新范式。噬菌体展示库提供了庞大的配体库，可以通过生物淘选进行搜索，以识别对各种生物学相关靶点具有高特异性和亲和力的多肽。尽管生物淘选在识别靶点特异性配体方面显示出巨大潜力，但许多通过噬菌体展示识别的多肽仍存在药理学性质较差的问题，这在将噬菌体展示选择的初始命中物转化为治疗分子方面造成了障碍。为了获得改善的药理学特性，可以向多肽中引入各种修饰，如环化、掺入非经典氨基酸、引入D-型氨基酸、寡聚化、缀合/融合以及装订。通过这些策略优化多肽性质，为大量源自噬菌体展示的多肽从基础研究和临床前研究进展到临床评估的各个阶段奠定了坚实基础，其中几种多肽药物已获得监管批准用于常规临床应用。这些成就为多肽噬菌体展示在未来几年继续保持作为药物发现的有前景平台带来了希望。

1. 引言

药物发现是一个复杂、昂贵且耗时的过程，涉及具有治疗特性的新化合物的鉴定、设计和开发。20世纪之前，药物发现主要依赖于试错法或偶然发现。随着分子结构测定、分子建模、分子生物学方法、组合化学、高通量筛选 (HTS) 和组学技术的突破，药物发现进入了更加理性的时代。在现代药物发现的初期，多肽就为治疗化合物的开发做出了重要贡献。多肽作为一类独特的治疗药物，占据了小分子和大型生物制剂之间的化学空间，结合了小分子良好的生物利用度和抗体的高靶向特异性。组合肽库在当代药物发现中发挥着不可或缺的作用，而噬菌体展示作为其中最重要和最广泛使用的组合肽平台之一，通过实现对各种生物靶点具有高特异性和亲和力的多肽的鉴定，彻底改变了药物发现。本文旨在为读者提供关于噬菌体展示技术在多肽药物发现和开发中作用的清晰见解，特别关注用于优化多肽药理学性质以推动其临床转化的修饰策略，以及回顾已获得FDA批准并常规用于临床的噬菌体展示源性多肽药物。

2. 肽与药物发现：超越小分子和大型抗体的可成药空间扩展

开发能够以高亲和力和特异性结合临床相关靶蛋白（如疾病相关的酶和受体）的小分子是学术界和工业界面临的重大挑战。随着生物制剂展现出满足新治疗化合物需求的潜力，多肽作为一种重要的生物制剂，一直是药物开发的宝贵灵感来源。多肽在充当生长因子、抗原、细胞因子、神经递质、离子通道配体、抗感染剂和激素等方面发挥着重要的生物活性作用。多肽具有独特的药理学特性，提供了小分子和大型抗体之外的“两全其美”的特征。它们可以与小分子靶向的疏水口袋相互作用，也可以与细胞表面受体高亲和力结合并诱导细胞内信号传导。与抗体相比，多肽具有免疫原性低、大批量生产更便捷且成本更低、表面密度更高等优势。尽管多肽具有上述优势，但它们也存在对蛋白水解降解敏感和体内稳定性差等缺点。然而，通过在多肽中引入各种修饰，可以优化其生化特性以解决这些限制。

3. 噬菌体展示与推进药物发现：在庞大的组合肽库中寻找治疗药物

随着组合化学和反向药理学的兴起，繁琐的试错过程被高通量的组合库筛选所取代。通过模拟自然进化，生物展示系统能够在高度多样化的库中寻找具有强靶点结合亲和力的候选物。噬菌体展示是一种最常被广泛采用的平台，其基础在于基因型（编码展示肽的遗传物质）和表型（展示的多肽）之间的物理联系。与其他合成化学库和细胞展示系统相比，噬菌体展示结合了非细胞和细胞展示系统的优势。然而，噬菌体展示也存在局限性，比如将外源肽融合至次要衣壳蛋白 (pIII) 会对跨膜转移和折叠施加结构限制，导致序列“审查”现象；同时，在亲和筛选中常产生非特异性结合，从而影响结果的可靠性。丝状噬菌体（如M13）和裂解性噬菌体（如T7）是两种主要的展示平台。丝状噬菌体由于其基因组易于操作和非裂解性增殖方式成为最广泛使用的系统。相反，裂解性噬菌体由于在细胞质内组装，避免了对分泌机制的依赖，能更好地容纳结构复杂或较大的插入片段。

4. 生物淘选与亲和力驱动的多肽发现：从噬菌体展示库中揭示靶标特异性结合物

为了寻找靶标特异性的多肽，噬菌体展示库需要通过生物淘选的亲和力筛选过程。该过程通过递呈库、洗去未结合的噬菌体、洗脱并扩增结合的噬菌体等步骤进行。在常规淘选中，常将靶蛋白固定在固相载体上，但这可能引起构象变化。洗脱策略也至关重要，特异性配体竞争性洗脱能引入生物学选择性。近年来，新一代测序技术 (NGS) 被结合进噬菌体展示中，通过大规模并行测序提供对多肽富集的深刻见解，减少了扩增偏差。为了减少非特异性背景结合，常规流程中可加入阴性筛选步骤。此外，活体淘选能直接在活动物体内进行筛选，保留了天然生理环境以识别组织归巢肽。同时，微流控平台的整合通过提供高度控制的筛选环境，优化了流体动力学和洗脱条件，减少了扩增偏差并提高了通量。

5. 从生物淘选命中物到治疗剂：克服噬菌体展示发现的多肽的药理学限制的修饰

尽管生物淘选在识别特异性配体方面显示出巨大潜力，但衍生出的多肽通常无法直接作为药物使用，存在半衰期短、对酶降解敏感等药理学缺点。为此研究人员引入了多种修饰策略：

5.1. 环化
环化能够改善多肽的结合亲和力、特异性和蛋白酶抗性。通过预先组织分子内相互作用，环化可限制结构构象，降低受体结合时的熵损失。环化策略分为筛选前环化和筛选后环化。前者通过基因编码引入半胱氨酸残基形成二硫键，后者则对筛选出的线性肽进行化学或酶促环化。近年来，双环肽库的构建和基于邻苯二甲醛 (OPA) 或酪氨酸酶的酶介导环化方法，显著扩展了大环肽的结构多样性和功能潜力。

5.2. 非经典氨基酸的掺入
非经典氨基酸 能通过引入独特的侧链反应基团，超越20种标准氨基酸的结构和功能限制。在噬菌体展示中应用遗传密码扩展技术，可利用正交氨基酰-tRNA合成酶/tRNA对，通过识别琥珀终止密码子实现ncAAs的定点掺入。这种方法不仅扩展了库的化学多样性，还能用于构建具有增强结构复杂性、稳定性和新功能的多肽库。

5.3. D-氨基酸的引入与镜像噬菌体展示
引入D-氨基酸能够显著增强多肽对蛋白酶降解的抗性、延长半衰期并降低免疫原性。镜像噬菌体展示是一种独特的方法，首先化学合成靶标的D-对映异构体，并使用该D-靶标筛选展示L-肽的噬菌体库。之后将结合L-肽化学合成为D-肽，这些D-肽即可特异性结合原始的L-靶标。反向异构肽由于保留了侧链拓扑结构，能够在具备抗蛋白酶能力的同时保留原始活性。

5.4. 寡聚化
许多源自噬菌体展示的多肽在脱离噬菌体语境后亲和力下降。寡聚化将单肽连接形成二聚体、三聚体等，能显著增强亲和力和生物活性。寡聚化可通过非共价或共价方式实现。例如，三赖氨酸可作为多聚化支架模拟M13噬菌体的价态。多聚化不仅能增强受体亲和力，还可以增强血清稳定性，并作为亲和力成熟的策略提升靶向递送效率。

5.5. 化学缀合与基因融合
该策略旨在通过增加多肽的流体动力学半径和分子量来延长半衰期、增强蛋白酶抗性。聚乙二醇化 (PEGylation) 通过连接聚乙二醇 (PEG) 链增加位阻并防止降解；脂质化则通过结合血清白蛋白减缓清除率并增强膜渗透。此外，基因融合技术可将多肽与人血清白蛋白或免疫球蛋白G (IgG) 的Fc片段融合，以显著延长体内半衰期。

5.6. 装订
装订技术通过在不同氨基酸侧链间引入共价交联，稳定多肽的α-螺旋结构。交联能限制骨架的构象自由度，保护稳定螺旋的分子内氢键，从而增强细胞渗透性、结合亲和力和蛋白酶稳定性。装订已成功用于构建靶向肿瘤相关蛋白相互作用的约束型噬菌体展示肽库，也可作为筛选后优化策略以提升胞内渗透和生物学功能。

5.7. 多肽优化与药物开发中的转化挑战与制造考量
将噬菌体展示肽转化为治疗产品需要克服一系列化学合成、纯化、工艺可扩展性和监管要求等挑战。复杂的多肽修饰可能降低合成效率并增加纯化成本。在从实验室规模向符合良好生产规范 (GMP) 的大规模生产转化过程中，序列可制造性、纯化策略、技术转移、可持续性问题和监管合规性都需要被综合评估。因此，药物发现与工艺开发应当被视为集成的连续过程，以最大化临床和商业转化成功率。

6. 临床批准的噬菌体展示衍生多肽与疾病治疗：拓宽药物发现的范围

自噬菌体展示诞生以来，已有多种衍生多肽获得FDA批准并应用于常规临床治疗：

6.1. Romiplostim
作为首个获批的“肽体”药物，由结合并激活促血小板生成素 (TPO) 受体的多肽序列与人IgG1的Fc结构域共价连接而成，用于治疗慢性免疫性血小板减少症 (ITP)。

6.2. Ecallantide
基于人脂蛋白相关凝血抑制剂第一Kunitz结构域通过噬菌体展示优化而来，是一种强效且可逆的人血浆激肽释放酶抑制剂，用于治疗急性遗传性血管性水肿 (HAE)。

6.3. Pegcetacoplan
一种聚乙二醇化的环肽，作为补体C3的强效抑制剂，用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿症 (PNH) 和地图状萎缩 (GA) 等补体过度激活相关疾病。

6.4. Tn 8.2 纯化多肽
是一种特异性结合凝血因子VIII的亲和配体肽，被用于在重组凝血因子VIII的商业生产中进行GMP级别的亲和纯化，排除了使用源自人或动物的亲和配体相关的安全风险。

6.5. Albiglutide
为GLP-1受体激动剂，由具有DPP-4抗性的改进型GLP-1类似物双体与人血清白蛋白融合而成，通过延长半衰期实现每周一次给药，用于治疗2型糖尿病。

6.6. Peginesatide
由两条通过PEG连接的相同二硫键肽链组成的促红细胞生成素受体 (EPOR) 激动剂，由于具备长效性曾获批用于治疗慢性肾病引起的贫血。尽管由于严重的过敏反应最终退市，其仍然展示了基于肽的模拟物激活复杂受体的前景。

7. 总结与未来展望

噬菌体展示技术重塑了多肽药物发现领域，通过在庞大的组合库中导航，成功实现了对各种靶点高亲和力、高特异性配体的识别。从不具备优良药代动力学的初始命中物，到经环化、非经典氨基酸掺入等修饰策略优化的候选物，多肽工程的研究进展为满足临床未竟医疗需求提供了必要条件。

展望未来，新技术的融合将进一步扩展噬菌体展示的能力。NGS技术通过全面深入地剖析富集动态、发现低丰度多肽并量化扩增偏差，显著提升了筛选结果的准确性和可靠性。同时，人工智能 (AI) 和机器学习算法在识别高亲和力序列特征、预测药理学属性和指导偏向库设计方面展现出巨大潜力。将AI的预测能力与噬菌体展示的实验多样性、NGS的数据深度相结合，药物发现过程将从经验性筛选逐渐过渡至数据驱动和理性指导的平台。此外，随着制药行业对多肽独特优势认知的加深，针对此前无法成药靶点的个性化精准多肽疗法将不断涌现。