电针通过抑制CaMKII/Drp1依赖性线粒体分裂预防TBI诱导的突触丢失

《Biomolecules》：Electroacupuncture Prevents TBI-Induced Synaptic Loss by Inhibiting CaMKII/Drp1-Dependent Mitochondrial Fission

　　

(1) 背景：创伤性脑损伤（TBI）触发突触丢失，导致长期神经功能缺损。电针（EA）对神经状况有益，但其在TBI后的机制仍不清楚。(2) 方法：研究人员使用控制性皮质冲击（CCI）小鼠模型。使用改良神经功能严重程度评分（mNSS）、转棒、Y迷宫和新物体识别测试（NORT）评估行为结果。通过透射电子显微镜（TEM）检查突触形态。使用生化检测评估能量代谢，使用流式细胞术评估线粒体功能。使用定量实时聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质印迹（WB）检查潜在分子机制。(3) 结果：研究人员发现EA通过保持突触和线粒体完整性改善TBI诱导的运动和认知障碍。EA处理的小鼠在mNSS、转棒、NORT和Y迷宫表现中显示改善，同时保持突触超微结构和线粒体功能。CaMKII过表达消除了EA诱导的神经保护，确定CaMKII/Drp1轴为关键介导者。(4) 结论：因此，EA通过抑制CaMKII/Drp1驱动的线粒体分裂和随后的突触丢失来限制TBI缺陷。

创伤性脑损伤（TBI）是全球范围内导致死亡和长期神经功能障碍的主要原因，幸存者常遗留运动协调障碍、认知衰退等持续性缺陷，严重影响日常生活能力。突触丢失被确认为TBI后神经退行性变的关键早期事件，其程度与远期功能预后高度相关。线粒体动力学失衡，特别是动力相关蛋白1（Drp1）介导的过度分裂，是突触丢失的重要上游机制。然而，现有药物和手术干预未能实现稳定的功能恢复，亟需探索新型治疗策略。电针（EA）作为一种多靶点神经调控手段，在多种中枢神经系统疾病中显示出保护作用，但其在TBI后是否通过调节线粒体分裂来保护突触，此前尚未明确。本研究旨在探讨EA是否通过抑制CaMKII/Drp1信号轴介导的线粒体分裂，从而减轻突触丢失并改善神经功能。论文发表在《Biomolecules》。

研究人员采用雄性C57BL/6J小鼠（6-8周龄，来源：广东致远生物医药科技有限公司）建立控制性皮质冲击（CCI）模型。主要关键技术方法包括：行为学评估（改良神经功能严重程度评分mNSS、转棒实验、新物体识别测试NORT、Y迷宫）；透射电子显微镜（TEM）观察突触和线粒体超微结构；JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电位（ΔΨm）；生化试剂盒测定ATP和AMP浓度；定量实时PCR（qPCR）和蛋白质印迹（WB）检测CaMKII、Drp1、p-Drp1^Ser616、MFN2、PSD95、SYN等蛋白表达；免疫荧光共定位p-Drp1^Ser616与线粒体标记TOM20；全细胞膜片钳记录自发抑制性突触后电流（sIPSC）；腺相关病毒（AAV，来源：BrainVTA，武汉）介导的CaMKII敲低（AAV-shCaMKII）和过表达（AAV-CA-CaMKII）通过脑室注射（ICV）进行。

研究结果如下：

**3.1 EA减轻TBI小鼠运动和认知缺陷**
通过mNSS、转棒、NORT和Y迷宫行为测试，研究人员发现TBI小鼠出现显著的神经功能缺损，而EA治疗显著改善了运动协调能力、识别记忆和空间工作记忆，表明EA促进TBI后功能恢复。

**3.2 EA通过减轻突触丢失促进功能恢复**
TEM分析显示，TBI小鼠损伤同侧皮质突触密度显著降低，突触后致密区（PSD）变薄、曲度减小；EA治疗有效恢复了突触密度和PSD形态。WB进一步证实EA上调了突触标志物PSD95和突触素（SYN）的蛋白水平，说明EA通过保护突触完整性发挥神经保护作用。

**3.3 EA促进能量供应并保护线粒体结构和功能**
生化检测显示TBI小鼠ATP水平下降、AMP水平升高，EA治疗显著逆转了这一能量代谢紊乱。TEM观察表明EA恢复了TBI引起的线粒体肿胀、空泡化和嵴丢失等超微结构损伤。JC-1染色流式细胞术显示EA提高了线粒体膜电位（ΔΨm），表明EA通过修复线粒体完整性和功能来改善能量代谢。

**3.4 EA通过对抗过度分裂减轻TBI诱导的线粒体功能障碍**
WB检测线粒体动力学相关蛋白，发现TBI后p-Drp1^Ser616/Drp1比值显著升高，MFN2表达下降，提示线粒体分裂过度；EA治疗有效降低了p-Drp1^Ser616/Drp1比值并上调MFN2。同时，TBI后CaMKII表达升高，EA则抑制其上调，提示EA通过CaMKII/Drp1轴调节线粒体分裂。

**3.5 EA通过靶向CaMKII/Drp1信号轴减轻TBI后线粒体分裂**
利用AAV介导的CaMKII敲低和过表达，WB显示CaMKII敲低模拟了EA对p-Drp1^Ser616、MFN2、PSD95和SYN的调节作用，而CaMKII过表达则消除了EA的效应。JC-1和ATP/AMP检测进一步证实，CaMKII敲低重复了EA对ΔΨm和能量代谢的改善，过表达则阻断EA的作用，证明CaMKII是EA保护线粒体功能的关键靶点。

**3.6 CaMKII/Drp1通路参与EA抑制TBI后线粒体分裂**
免疫荧光共定位显示，EA组p-Drp1^Ser616荧光强度较TBI组降低，TOM20荧光增强；CaMKII敲低模拟该变化，过表达则逆转EA效应。免疫沉淀联合ELISA（IP-ELISA）定量检测Drp1蛋白，发现EA干预后总Drp1蛋白水平升高，提示EA不仅抑制Drp1磷酸化激活，还可能通过补偿性上调总Drp1进一步调节分裂过程。

**3.7 CaMKII在EA改善TBI后突触传递和神经恢复中发挥关键作用**
全细胞膜片钳记录显示，EA显著提高sIPSC频率（不改变幅度），CaMKII敲低产生类似效应，而CaMKII过表达消除EA的促进作用。转棒、NORT和Y迷宫行为测试结果一致：CaMKII敲低模拟EA的运动和认知改善，过表达则完全阻断EA的恢复作用，证实在多行为维度上CaMKII均是EA神经保护的关键介导者。

在讨论部分，研究人员总结了EA通过抑制CaMKII/Drp1信号轴介导的过度线粒体分裂，维持线粒体稳态和能量代谢，从而减轻突触丢失，最终改善TBI后的运动与认知功能。研究确认了CaMKII作为上游激酶调控Drp1磷酸化的关键角色，但指出CaMKII完全抑制可能有害，而EA作为多靶点方法具有优势。研究局限性包括未设置健康动物EA对照组、未系统分析对侧半球变化、以及仅使用雄性小鼠。结论部分翻译如下：总之，本研究表明，电针通过CaMKII/Drp1依赖性机制维持线粒体和突触完整性，从而保护TBI后神经功能。研究人员不仅确认了CaMKII的关键作用，还确定了其调控的具体级联反应。尽管这揭示了一个有前景的治疗靶点，但还需要进一步研究以更详细地解析该网络并探索其全部临床潜力。