使用靶向神经氨酸酶（NA）的侧流免疫层析法快速检测N9亚型禽流感病毒

《Viruses》：Rapid Detection of N9 Subtype Avian Influenza Viruses Using an NA-Targeting Lateral Flow Immunoassay

　　

高致病性禽流感病毒（AIVs）的出现对全球公共卫生和家禽经济构成重大威胁。针对血凝素（HA）蛋白的快速检测方法由于持续的抗原漂移和基因突变而变得日益不可靠。在本研究中，研究人员筛选了两种针对高度保守的神经氨酸酶（NA）蛋白的单克隆抗体（mAbs），这些抗体对N₉亚型具有高亲和力和特异性。利用配对单克隆抗体12A2和12F12，开发了一种靶向神经氨酸酶的侧流免疫层析法（NA-LFIA），用于快速检测N₉亚型AIVs。该NA-LFIA表现出卓越的特异性，与N₁、N₂或N₆亚型无交叉反应。检测限（LODs）确定为病毒103.3 TCID₅₀/0.1 mL，重组NA蛋白98 ng/mL。试纸条在检测NA抗原方面表现出优异的重复性，批内和批间变异系数分别为5.32%和6.05%。稳定性测试证实了六个月的有效期，且灵敏度无任何损失。这些发现表明，NA-LFIA是一种稳健、快速的即时检测（POCT）工具，用于早期检测N₉亚型AIV感染。

高致病性禽流感病毒（AIVs）的持续出现对全球公共卫生和家禽经济构成严重威胁。现有针对血凝素（HA）蛋白的快速检测方法因抗原漂移和基因突变而可靠性下降，而神经氨酸酶（NA）蛋白相对保守，特别是其催化位点和第二唾液酸结合位点高度保守，是更理想的检测靶标。为克服HA靶向检测的局限性，研究人员开展本研究，旨在开发一种基于NA蛋白的快速检测工具。研究人员从H7N9 AIV免疫小鼠中筛选出两株针对N₉亚型NA蛋白的高亲和力单克隆抗体（mAbs）12A2和12F12，并基于此构建了靶向NA的侧流免疫层析法（NA-LFIA）试纸条。该试纸条对多种H7N9和H11N9分离株及疫苗毒株（H7-Re1至Re4）具有广谱反应性，对N₁、N₂、N₆等亚型无交叉反应，检测限（LOD）为103.3 TCID₅₀/0.1 mL（病毒）和98 ng/mL（重组NA蛋白），批内和批间变异系数分别为5.32%和6.05%，在4°C储存6个月后灵敏度无损失。临床组织样本检测结果与RT-PCR完全一致（12/12阳性，0/4阴性）。该研究发表在《Viruses》期刊上，表明NA-LFIA是一种快速、可靠、适用于现场即时检测（POCT）的工具，可用于N₉亚型AIV感染的早期筛查。

**主要关键技术方法：**
研究人员通过免疫小鼠（BALB/c）制备单克隆抗体，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）筛选出9株N₉ NA特异性mAbs，并利用表面等离子共振（SPR）测定亲和力，通过间接免疫荧光（IFA）和Western blot验证特异性。采用柠檬酸三钠法制备胶体金纳米颗粒（AuNPs），将筛选出的配对mAb 12F12与AuNPs偶联，12A2作为捕获抗体固定于硝酸纤维素膜（NC膜）上，组装成侧流免疫层析试纸条。样本来源包括华南农业大学、浙江大学、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所等机构提供的多种禽流感病毒（AIVs）及新城疫病毒（NDV）等其他禽病毒，以及来自中国洛阳养禽场的50份口咽拭子样本和6只实验感染鸡的呼吸道组织样本。

**研究结果：**
**3.1 NA-LFIA配对单克隆抗体的筛选**
通过夹心点印迹法，将9株mAbs分别作为捕获抗体固定于NC膜上，用灭活H7N9病毒孵育后，再用AuNP标记的各mAbs检测，结果显示12F12作为检测抗体时，12A2所在位置颜色最深，确定12A2和12F12为最佳配对。

**3.2 配对单克隆抗体的特性**
12A2和12F12的抗体效价均为10^-6（IPMA），SPR测得的亲和常数（KD）分别为5.77×10^-10 M和7.82×10^-11 M，均属高亲和力。两者均为IgG1/κ轻链亚型，IFA显示对瞬时表达NA蛋白的HEK293T细胞具有强特异性，Western blot识别约70 kDa的病毒NA蛋白。

**3.3 NA-LFIA试纸条的制备**
将12F12-AuNP偶联物喷涂于玻璃纤维垫上，12A2和金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）分别喷涂于NC膜上作为检测线和质控线，组装成试纸条。

**3.4 NA-LFIA试纸条的广谱反应性**
所有测试的N₉亚型AIVs（H7N9和H11N9）以及疫苗毒株H7-Re1、Re2、Re3、Re4均呈现两条红线，表明试纸条对N₉亚型具有广谱检测能力。

**3.5 NA-LFIA试纸条的特异性**
仅N₉亚型AIVs在检测线和质控线出现两条红线，而N₁、N₂、N₆、N₇亚型AIVs及其他禽病毒（NDV、IBDV、IBV、MDV）仅显示一条质控线，表明试纸条对N₉亚型具有高度特异性。

**3.6 NA-LFIA试纸条的灵敏度**
使用H7N9 AIV（A/chicken/Guangdong/G1/2013）和重组NA蛋白进行倍比稀释检测，两者均可在稀释至2^-9（1:512）时呈阳性，计算得LOD分别为103.3 TCID₅₀/0.1 mL和98 ng/mL。

**3.7 NA-LFIA试纸条的重复性**
使用三个批次试纸条检测不同浓度NA蛋白，批内平均变异系数（CV）为5.32%，批间CV为6.05%，表明重复性良好。

**3.8 NA-LFIA试纸条的稳定性**
在4°C储存6个月后，试纸条仍能检测2^-9稀释的H7N9 AIV，且无交叉反应，表明稳定性高。

**3.9 临床样本检测**
对6只H7N9感染鸡和2只未感染鸡的气管和肺组织样本进行检测，NA-LFIA结果与RT-PCR完全一致（感染组织12/12阳性，未感染组织0/4阳性）。对采自洛阳养禽场的50份口咽拭子样本，NA-LFIA和RT-PCR均未检出H7N9 AIV抗原或RNA。

**讨论与结论总结：**
讨论部分指出，NA蛋白是流感病毒的第二大表面糖蛋白，其活性位点高度保守，抗NA抗体可能比抗HA抗体提供更广的交叉反应性。本研究筛选出的两株mAbs（12A2和12F12）具有纳摩尔级亲和力，并表现出神经氨酸酶抑制（NI）活性（IC₅₀ = 9.77 ng/mL），但无显著中和活性，提示它们可能通过空间位阻而非直接结合活性位点来抑制NA活性。NA-LFIA试纸条比现有HA靶向试纸条具有更广的谱系反应性，能检测包括H7-Re4在内的最新疫苗毒株，且灵敏度相当（LOD = 103.3 TCID₅₀/0.1 mL）。由于2017年以来中国强制免疫计划的成功，H7N9野外流行率大幅下降，限制了阳性临床拭子样本的获取，但动物感染模型提供了组织验证的替代方案，未来将重点利用临床拭子样本进一步验证。研究结论翻译为：该NA-LFIA作为一种快速、简便、可靠的即时检测（POCT）技术，在N₉亚型AIV感染的现场快速检测中具有巨大潜力。