CEBPB-IPO4-FASN-MAVS轴限制先天免疫激活和病毒性肺炎

《Cell Reports》：A CEBPB-IPO4-FASN-MAVS axis limits innate immune activation and viral pneumonia

　　

呼吸RNA病毒感染期间先天免疫的失调导致全身性过度炎症和肺损伤。在这里，研究人员表明importin β4 (IPO4)在抑制抗病毒先天免疫中发挥作用。转录组学分析显示，在重症COVID-19或流感患者的肺泡巨噬细胞、肺纤毛上皮和外周血单个核细胞中IPO4表达下调。研究人员进一步确定了CCAAT/增强子结合蛋白β (CEBPB)是RNA病毒感染期间IPO4减少的转录因子。功能缺失验证表明IPO4在体外和体内减弱了先天抗病毒和炎症反应。机制上，IPO4隔离脂肪酸合酶(FASN)以阻断棕榈酸产生，从而抑制线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)激活和下游先天免疫信号传导。此外，腺相关病毒(AAV)介导的肺部IPO4恢复显著减轻了小鼠的病毒性肺炎。这些结果表明CEBPB-IPO4-FASN-MAVS轴维持先天免疫稳态以避免炎症病理，强调了IPO4作为重症病毒性肺炎潜在治疗靶点。

**论文解读：CEBPB-IPO4-FASN-MAVS轴限制先天免疫激活与病毒性肺炎**

**研究背景与问题提出**

呼吸道RNA病毒（如甲型流感病毒（IAV）、冠状病毒（CoVs）和呼吸道合胞病毒（RSV））的持续流行是呼吸道传染病高致病率和死亡率的主要原因。重症病毒性肺炎常表现为细胞因子风暴综合征，即由失控的免疫应答导致的全身性过度炎症，其特征是免疫细胞过度激活和炎症细胞因子过量释放。因此，阐明维持先天免疫稳态以防止肺部过度炎症的关键细胞因子或信号轴，对于开发针对重症病毒性肺炎的靶向干预措施至关重要。

先天免疫和炎症反应由病毒诱导的抗病毒信号启动。呼吸道RNA病毒感染气道上皮和肺上皮后，胞质传感器如RIG-I和MDA5识别病毒RNA，激活线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）。激活的MAVS通过其类朊病毒样聚集体募集TBK1和IKKs，进而激活IRF3和NF-κB，诱导I型干扰素（IFN-α/β）和促炎介质表达。然而，先天免疫在免疫病理过程中常被呼吸道RNA病毒扭转，成为双刃剑。先前的研究表明，在COVID-19和流感免疫病理早期，病毒逃逸先天免疫，导致上呼吸道病毒快速增殖并向肺部传播。在肺部，滞后的先天免疫反应常具有攻击性和失控性，过度激活的先天抗病毒信号引发“细胞因子风暴”，导致严重组织损伤和多器官衰竭。因此，研究防止先天免疫过度激活的调控机制对治疗重症病毒性肺炎至关重要。

**研究目的与主要发现**

本研究旨在探索importin β家族成员，特别是IPO4，在呼吸道RNA病毒感染中调控先天免疫的作用。研究人员通过分析临床样本的转录组数据、体外细胞实验、体内小鼠模型以及机制研究，发现了一个由CEBPB-IPO4-FASN-MAVS构成的新轴，该轴限制先天免疫激活和病毒性肺炎。研究论文发表在《Cell Reports》上。

**主要关键技术方法**

1. **临床样本队列分析**：利用公开的单细胞RNA测序数据（来自健康对照和重症COVID-19患者的支气管肺泡灌洗液（BALF））以及自测的外周血单个核细胞（PBMCs）bulk RNA测序数据（来自健康对照、轻症和重症流感患者），分析了importin β家族基因表达变化。
2. **功能缺失与获得实验**：通过CRISPR/Cas9敲除和siRNA敲低技术在人类细胞系（HEK293T、A549）中验证IPO4功能；利用骨髓特异性Ipo4条件敲除小鼠（Ipo4^fl/flLyz2-Cre）及其对照进行体内研究。
3. **机制研究**：采用免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）鉴定IPO4相互作用蛋白；利用DNA pull-down结合LC-MS/MS筛选调控IPO4表达的转录因子；通过酰基生物素交换（ABE）实验、半变性去污剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）、线粒体分离和免疫荧光等分析MAVS棕榈酰化、聚集和线粒体定位。
4. **治疗干预**：通过腺相关病毒（AAV6）介导的肺部IPO4恢复实验，评估其对小鼠流感病毒性肺炎的缓解效果。

**研究结果**

**1. IPO4表达在呼吸道RNA病毒免疫病理过程中显著下调**

通过对重症COVID-19患者BALF单细胞RNA测序数据分析，发现IPO4在肺泡巨噬细胞（AMs）和纤毛上皮细胞中表达显著下调，且与促炎细胞因子（如TNF、CXCL10、IL6）表达呈负相关。在重症流感患者PBMCs的bulk RNA测序中也观察到IPO4 mRNA下调，并与IL16、TNF、IL1B、IL6等炎症基因表达负相关。体外实验证实，多种RNA病毒（IAV、SARS-CoV-2 trVLP、RSV、SeV、VSV）和poly(I:C)均能下调IPO4/Ipo4 mRNA和蛋白水平，而DNA病毒HSV-1则上调其表达。

**2. IPO4缺失增强人类细胞系对RNA病毒的先天免疫反应**

在HEK293T和A549细胞中，IPO4敲除显著增强VSV、SeV、PR8、RSV或poly(I:C)诱导的IFNB1、IL6和CXCL10转录。使用importin β家族核转运抑制剂Importazole（IPZ）的实验表明，IPO4对先天免疫的抑制作用不依赖于其经典的核转运功能。

**3. Ipo4缺失增强小鼠原代细胞对RNA病毒的先天免疫反应**

从Ipo4^fl/flLyz2-Cre小鼠（髓系特异性Ipo4敲除）分离的BMDMs和AMs，在多种RNA病毒或poly(I:C)刺激后，Ifnb1、Il6和Cxcl10转录显著增强，AMs分泌的IFN-β、IL-6和CXCL10蛋白水平也升高。在Ipo4敲低的原代小鼠肺泡上皮细胞（AECs）中也观察到类似结果。

**4. Ipo4在体内抑制RNA病毒触发的先天免疫反应**

Ipo4^fl/flLyz2-Cre小鼠感染致死剂量PR8后，体重减轻更明显，存活率降低，肺病毒载量升高，肺组织Ifnb1、Il6、Cxcl10转录和BALF中IL-6、CXCL10蛋白水平增加，H&E染色显示肺部炎症细胞浸润加剧。使用UV灭活PR8（UV-PR8）感染后，Ipo4敲除小鼠仍表现出更高的肺部炎症因子转录，表明该效应独立于病毒复制。

**5. 转录因子CEBPB在RNA病毒感染期间降低IPO4表达**

通过DNA pull-down联合LC-MS/MS和数据库筛选，鉴定出转录因子CEBPB在VSV感染后结合IPO4启动子。双荧光素酶报告基因实验、ChIP-qPCR等功能验证表明，RNA病毒感染诱导CEBPB上调，CEBPB直接结合IPO4核心启动子区域，抑制其转录，导致IPO4表达下降。

**6. 病毒感染增强IPO4与FASN的相互作用**

IP-MS分析发现IPO4与脂肪酸合酶（FASN）相互作用，且病毒感染（SeV、PR8）增强该相互作用。Co-IP和免疫荧光证实了此互作，并定位到IPO4的N端（90-350 aa）和FASN的硫酯酶结构域。

**7. IPO4通过抑制棕榈酰化依赖性MAVS激活来抑制RNA病毒触发的先天免疫**

IPO4敲除后，PR8感染导致A549细胞游离脂肪酸（FFA）和棕榈酸水平升高，FASN酶活性增强。ABE实验显示IPO4敲除增强MAVS棕榈酰化，而FASN抑制剂C75可逆转该效应。IPO4敲除促进了PR8诱导的MAVS线粒体定位和聚集，增强了TBK1、IRF3、IKKβ和p65的磷酸化。C75处理可逆转这些增强效应。因此，IPO4通过结合FASN抑制其活性，减少棕榈酸合成，进而抑制MAVS棕榈酰化、聚集和下游信号激活。

**8. AAV恢复IPO4表达缓解PR8诱导的肺部炎症**

通过气管内注射AAV6-Flag-IPO4在小鼠肺部恢复IPO4表达后，PR8感染导致小鼠体重减轻减轻、存活率提高，肺病毒载量降低，肺组织Ifnb1、Il6、Cxcl10转录和BALF中IL-6、CXCL10蛋白水平下降，肺部炎症细胞浸润减少。

**总结与讨论**

本研究揭示了核转运蛋白IPO4在抑制呼吸道RNA病毒诱导的过度先天免疫反应中的非经典角色。研究人员发现，呼吸道RNA病毒感染激活转录因子CEBPB，CEBPB下调IPO4表达。IPO4减少解除了其对FASN活性的抑制，导致棕榈酸产生增加，进而促进MAVS的棕榈酰化依赖激活，引发持续的先天免疫信号和过度炎症反应。该研究建立了CEBPB-IPO4-FASN-MAVS轴，该轴维持先天免疫稳态以避免炎症病理。此外，通过AAV介导的肺部IPO4恢复可有效缓解小鼠病毒性肺炎，提示IPO4可能作为重症病毒性肺炎的潜在治疗靶点。研究结论为：CEBPB-IPO4-FASN-MAVS轴维持先天免疫稳态以避免炎症病理，强调了IPO4作为重症病毒性肺炎潜在治疗靶点的价值。