酰基辅酶A合成酶3（ACSF3）的昼夜节律调控控制线粒体赖氨酸丙二酰化的节律性和每日肝脏代谢

《Cell Reports》：Diurnal regulation of Acyl-CoA synthetase 3 (ACSF3) governs rhythmic mitochondrial lysine-malonylation and daily hepatic metabolism

　　

受进食影响，ACSF3驱动节律性线粒体赖氨酸丙二酰化。多组学揭示ACSF3驱动的丙二酰化靶点遍及关键代谢通路。肝脏Acsf3敲低破坏胰岛素信号和每日葡萄糖处理，同时伴随每日自噬增加而促进脂肪生成。每日肝脏节律由进食和分子昼夜节律钟协调，确保代谢稳态。紊乱的进食时间安排促进昼夜节律失调和代谢疾病，但潜在机制仍不清楚。翻译后修饰已成为昼夜节律代谢输出的关键调节因子。在此，研究人员展示线粒体酶酰基辅酶A合成酶家族成员3（ACSF3）与不同进食时间安排同步振荡，驱动节律性赖氨酸丙二酰化并协调每日肝脏代谢。肝脏Acsf3敲低显著影响赖氨酸丙二酰化节律，降低空腹血糖、胰岛素敏感性和AKT磷酸化，表明葡萄糖稳态紊乱。同时，Acsf3敲低将脂质氧化从线粒体转向过氧化物酶体，增强脂肪生成和甘油三酯合成，同时增加每日自噬。多组学分析揭示了糖酵解、三羧酸（TCA）循环、脂肪酸氧化和自噬中特定的赖氨酸丙二酰化靶点。研究人员的发现揭示肝脏ACSF3是一个关键的分子枢纽，整合进食时间与动态蛋白质赖氨酸丙二酰化，并协调肝脏代谢的昼夜节律。

### 论文解读：肝脏ACSF3通过调控节律性线粒体赖氨酸丙二酰化协调每日代谢

#### 研究背景与问题
现代生活方式中不规律的进食等昼夜节律破坏行为，会扰乱每日节律并促进代谢疾病，如2型糖尿病和代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）。这些节律由环境线索（如进食）与分子昼夜节律钟之间的相互作用协调，维持代谢稳态。进食时间安排的紊乱会诱导昼夜节律失调，但其分子机制尚不明确。翻译后修饰（PTM）已被认为是昼夜节律代谢输出的关键调节因子。线粒体作为代谢节律性的中心枢纽，其内部酸性环境有利于PTM自发发生，例如依赖乙酰辅酶A（acetyl-CoA）的赖氨酸乙酰化。其中，线粒体去乙酰化酶Sirtuin-3（SIRT3）主要调控肝脏线粒体赖氨酸乙酰化节律，而Sirtuin-5（SIRT5）具有强去丙二酰化酶活性。赖氨酸丙二酰化（Lysine-malonylation）依赖于丙二酰辅酶A（malonyl-CoA），这是从头脂肪生成和β-氧化调控的关键代谢物。SIRT5敲除（KO）研究将赖氨酸丙二酰化与糖酵解调控及肝脏代谢表型联系起来。然而，关于赖氨酸丙二酰化及其关键酶——酰基辅酶A合成酶家族成员3（ACSF3）——在体内每日肝脏代谢中的作用，目前认知有限。ACSF3通过将丙二酸转化为线粒体丙二酰辅酶A，从而为三羧酸（TCA）循环或II型脂肪酸合成提供原料，并控制线粒体赖氨酸丙二酰化。此前研究发现，ACSF3在体外影响昼夜节律周期，且肝脏丙二酰辅酶A水平随进食波动，但ACSF3如何整合进食时间与每日肝脏代谢的分子机制仍不清楚。因此，研究人员开展本研究，旨在阐明肝脏ACSF3及其介导的赖氨酸丙二酰化如何参与每日肝脏代谢的调控。

#### 研究内容与结论
研究人员通过分析小鼠肝脏总蛋白提取物（TE）和线粒体提取物（ME）的蛋白质组学数据，发现ACSF3和线粒体赖氨酸丙二酰化呈现昼夜节律性，且主要由进食时间安排而非分子昼夜节律钟驱动。高脂饮食（HFD）会改变ACSF3和赖氨酸丙二酰化的节律性。通过肝脏特异性敲低（KD）Acsf3（使用AAV递送shRNA），研究人员发现，在对照饮食（CD）下，Acsf3 KD改善了葡萄糖耐量但损害了胰岛素敏感性，并导致空腹血糖升高、AKT磷酸化降低，表明葡萄糖稳态紊乱。同时，Acsf3 KD增强了肝脏脂肪生成和甘油三酯（TG）合成，并促进了每日肝脏自噬。多组学分析（包括蛋白质组、丙二酰组、代谢组、脂质组和转录组）揭示，ACSF3调控的赖氨酸丙二酰化靶点涉及糖酵解、TCA循环、脂肪酸氧化、自噬等关键代谢通路。该研究揭示了肝脏ACSF3作为整合进食时间与动态蛋白质赖氨酸丙二酰化的关键分子枢纽，协调肝脏代谢的昼夜节律。论文发表在《Cell Reports》。

#### 主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术方法（样本来源于C57/BL6J雄性小鼠）：1）利用肝脏总蛋白提取物和线粒体提取物进行蛋白质组学分析，结合CircaCompare软件进行昼夜节律性评估；2）通过AAV8递送shRNA实现肝脏特异性Acsf3敲低，并进行葡萄糖耐量测试（GTT）和胰岛素耐量测试（ITT）以及血糖监测；3）采用稳定同位素标记（SILAC）结合质谱（MS）进行丙二酰组学分析，鉴定赖氨酸丙二酰化位点；4）进行靶向代谢组学（LC-MS）和脂质组学（LC-HRMS）分析肝组织代谢物和脂质；5）通过RNA测序（BRB-seq）进行转录组分析，并利用VIPER算法推断转录因子活性。

#### 研究结果（保留小标题）

**1. 总蛋白和线粒体蛋白质组的比较分析揭示ACSF3和赖氨酸丙二酰化的昼夜节律性**
通过分析已发表的小鼠肝脏总蛋白提取物和线粒体提取物的蛋白质组数据，发现约5%（TE）和25%（ME）的蛋白质呈节律性表达。其中，线粒体特异性节律蛋白富集于钙信号和II型脂肪酸合成通路。ACSF3在ME中呈现显著的昼夜节律，在zeitgeber time（ZT）21达峰，而赖氨酸丙二酰化在ME中亦呈节律性，峰值略晚于ACSF3。SIRT5和MLYCD也表现出节律性。这些节律主要由进食行为而非分子昼夜节律钟驱动。

**2. 进食时间安排调控肝脏ACSF3的每日表达并影响线粒体赖氨酸丙二酰化**
通过比较随意进食（AL）、夜间限制进食（nRF）和白天限制进食（dRF）下的小鼠，发现nRF增加ACSF3在ZT0与ZT12之间的差异，而dRF则减弱该模式，并逆转了赖氨酸丙二酰化的节律性。这表明ACSF3表达和线粒体赖氨酸丙二酰化受进食时间安排调节。

**3. 饮食诱导肥胖改变ACSF3的昼夜节律性表达**
在连续12周饲喂高脂饮食（HFD）的小鼠中，HFD增强了线粒体赖氨酸丙二酰化、ACSF3和SIRT5的节律性，并提高了ACSF3、MECR和SIRT5的中线估计统计量（mesor）水平，同时降低了MLYCD的节律性。这表明HFD相关的线粒体赖氨酸丙二酰化节律改变与ACSF3和SIRT5的协调表达变化一致。

**4. 肝脏Acsf3敲低影响对照饮食下的葡萄糖代谢**
在CD下，肝脏Acsf3 KD导致体重增加，ZT0血糖升高，但6小时空腹血糖降低。葡萄糖耐量改善而胰岛素敏感性受损。这些效应在HFD下消失。这表明Acsf3 KD在CD下扰乱了肝脏每日葡萄糖代谢。

**5. 肝脏ACSF3影响葡萄糖和脂质代谢相关蛋白的每日赖氨酸丙二酰化**
通过SILAC-MS分析，在Acsf3 KD小鼠肝脏中鉴定出842个丙二酰化位点（370个蛋白）。44%的差异位点位于线粒体。Acsf3 KD导致44%的位点mesor下调，12.4%的位点获得节律性。ACSF3调控的丙二酰化靶点富集于抗氧化防御、氨基酸、葡萄糖和脂质代谢通路。其中，糖代谢蛋白的丙二酰化改变尤为显著。

**6. Acsf3 KD扰乱每日肝脏脂质代谢并促进甘油三酯合成**
代谢组学分析显示，Acsf3 KD增加了丙二酸水平，降低了丙二酰辅酶A与丙二酸比值，并破坏了其节律性。脂质代谢方面，线粒体β-氧化蛋白下调，而过氧化物酶体β-氧化和从头脂肪生成蛋白上调。脂质组学分析表明，大多数节律性脂质（主要是甘油三酯TG及其前体）在Acsf3 KD后失去节律性，长链TG的mesor升高。同时，脂滴相关蛋白表达增加。这表明Acsf3 KD导致脂质代谢向脂肪生成和TG合成转变。

**7. Acsf3 KD重新编程肝脏葡萄糖和线粒体代谢的每日动态，以促进脂肪生成**
Acsf3 KD导致AKT磷酸化（Ser473）mesor降低，表明胰岛素敏感性下降。血糖节律性被破坏，肝糖原积累相位提前。糖酵解产物丙酮酸减少，而脂肪生成中间体磷酸二羟丙酮（DHAP）增加。TCA循环代谢物（如苹果酸、柠檬酸）的节律性受损。线粒体电子传递链（ETC）蛋白表达紊乱，ATP/ADP比值节律性减弱，线粒体呼吸降低。这些发现表明Acsf3 KD将肝脏能量代谢转向脂肪酸、胆固醇和TG合成。

**8. Acsf3 KD在转录和转录后水平扰乱每日肝脏代谢**
转录组分析显示，Acsf3 KD影响了21%的转录本节律性，但核心昼夜节律钟转录本不受影响。neddylation通路受扰最大。与肝胰岛素受体敲除（Hep-Insr-KO）小鼠的数据比较发现，部分转录水平变化存在重叠。此外，许多基因的转录和蛋白水平变化不一致，提示存在转录后调控机制。

**9. Acsf3 KD扰乱并促进每日肝脏自噬**
组织学分析显示，Acsf3 KD后脂滴大小分布无显著变化，提示存在补偿机制。蛋白质组学分析表明，37.6%的自噬相关蛋白和32.3%的溶酶体蛋白在Acsf3 KD后受影响，多数表现为mesor升高或获得节律性，包括分子伴侣介导的自噬（CMA）组分。时间富集分析显示，脂滴蛋白在白天和黑暗期开始时富集，随后溶酶体蛋白富集。转录因子活性分析表明，自噬激活因子活性增加，抑制因子ZKSCAN3活性降低。在AML12肝细胞中，Acsf3 KD直接增强了自噬通量（LC3B-II和p62/SQSTM1积累增加）。因此，肝脏Acsf3 KD增强每日肝脏自噬。

#### 总结与讨论部分及研究结论
讨论部分指出，ACSF3的每日表达和线粒体赖氨酸丙二酰化呈现节律性且同步，主要受进食时间安排驱动，而非分子昼夜节律钟。HFD或进食时间错乱会通过扰乱胰岛素和糖皮质激素信号来影响ACSF3的表达和节律。肝脏Acsf3 KD导致选择性胰岛素抵抗状态，肝脏无法正常调控每日葡萄糖稳态，从而促进从头脂肪生成、TG和胆固醇合成，同时加剧每日肝脏自噬。多组学数据揭示了ACSF3调控的特定赖氨酸丙二酰化靶点（如PYGL、GAPDH、IDH1），这些可能直接参与代谢表型。此外，许多差异丙二酰化位点也可发生其他PTM（如琥珀酰化、泛素化），提示ACSF3可能通过影响PTM动态来调控蛋白表达和活性。该研究结果与ACSF3缺陷患者成纤维细胞中的发现一致，即ACSF3缺失扰乱自噬-溶酶体功能、氧化磷酸化等。总体而言，ACSF3控制的丙二酸节律性可能是驱动氧化磷酸化每日节律的额外机制。

**研究结论翻译**：总之，研究人员证明，在肝脏中，ACSF3及其介导的线粒体赖氨酸丙二酰化是由进食时间安排调控的节律性过程。研究人员的多组学方法揭示，肝脏ACSF3在精细调控肝脏葡萄糖稳态、脂肪生成和TG合成的每日节律中发挥关键作用，而这些过程被增加的每日肝脏自噬所平衡。考虑线粒体靶点（如肝脏ACSF3）的每日节律性，可能为管理代谢疾病提供新的诊断和治疗途径。