《Cell Reports》：A pooled CRISPR-based neuronal activity screen links TMEM50A-dependent MVB function to synaptic integrity and remote memory
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尽管组学分析技术的进步迅速扩展了与健康和疾病状态下脑活动相关基因的目录，但功能注释仍远远落后。在此，研究人员建立了一个高通量功能基因组学平台，该平台将钙整合传感器CaMPARI2与CRISPRi筛选相结合，用于人类iPSC来源的神经元。通过将累积的神经元活性转
尽管组学分析技术的进步迅速扩展了与健康和疾病状态下脑活动相关基因的目录，但功能注释仍远远落后。在此，研究人员建立了一个高通量功能基因组学平台，该平台将钙整合传感器CaMPARI2与CRISPRi筛选相结合，用于人类iPSC来源的神经元。通过将累积的神经元活性转化为稳定的、可被流式细胞术读取的信号，这种方法能够通过混合筛选实现系统性的功能 interrogation。利用一个聚焦的记忆相关基因文库，研究人员筛选到了已知的调控因子，并鉴定出TMEM50A——一个此前未被表征的蛋白质——作为神经元活性的关键调控因子。TMEM50A与LEPROTL1形成复合物，并与多泡体（MVBs）上的ESCRT-III机制相关联。TMEM50A的缺失损害了MVBs的功能，重塑了神经元表面蛋白质组，降低了突触密度，并改变了小鼠的行为。该平台能够系统性地发现神经元活性调控因子，并揭示了TMEM50A依赖性MVB功能在维持突触完整性和行为中的关键作用。
**背景与意义**
神经元活性是神经元的基本生理特性，其失调与癫痫、神经退行性疾病和神经发育障碍等多种神经系统疾病密切相关。尽管离子通道、突触组装因子以及转录和翻译后调控因子等关键调控因子已被鉴定，但控制神经元活性的分子机制仍未完全阐明，且缺乏系统性的研究方法。近年来，单细胞转录组学等组学技术已鉴定出大量与学习和记忆相关的差异表达基因（DEGs），但如何从这些候选基因列表中甄别出真正因果性调控神经元活性和行为的基因，并阐明其分子和细胞机制，是当前面临的主要挑战。
系统性地鉴定调控神经元活性的基因一直受到缺乏高通量筛选工具的限制。膜片钳电生理学虽为金标准但通量低；钙离子和电压成像虽能提供光学读数，但捕捉的是瞬时的动态信号，需要实时监测，限制了通量。CaMPARI作为一种钙整合器，能够在特定光照窗口内将累积的钙活性转化为稳定的红/绿（R/G）荧光比值，从而将瞬时的神经元活性转化为稳定、可积分的荧光参数。本研究利用CaMPARI的这一特性，并结合荧光激活细胞分选（FACS）和CRISPRi遗传筛选平台，建立了高通量、可规模化的神经元活性检测方法，旨在系统性地发现新的神经元活性调控因子。
**研究方法与主要技术**
研究人员将CaMPARI2整合到基于CRISPRi的人类iPSC来源神经元（iNeurons）平台中。关键的技术方法包括：（1）利用慢病毒转导将CaMPARI2引入携带doxycycline诱导型NGN2和dCas9-BFP-KRAB的iPSCs中，并分化为人谷氨酸能神经元；（2）建立基于CaMPARI2光转换的流式细胞术检测方法，通过红/绿（R/G）荧光比值定量神经元活性；（3）构建靶向64个记忆相关基因的sgRNA文库，进行混合CRISPRi筛选，并通过MAGeCK-iNC分析鉴定候选基因；（4）采用免疫沉淀-质谱（IP-MS）鉴定TMEM50A的相互作用蛋白；（5）结合全细胞膜片钳电生理记录、表面蛋白质组学、超分辨荧光显微镜和扫描电子显微镜（SEM）等技术，对TMEM50A的功能进行深入表征。此外，研究还使用了CRISPR-Cas9介导的内源标签敲入（KI）策略和Tmem50a敲除（KO）小鼠模型进行体内验证。
**研究结果**
**1. 建立基于CaMPARI2的高通量神经元活性定量方法（Establishing a CaMPARI2-based high-throughput method to quantify neuronal activity in human iNeurons）**
研究人员首先验证了CaMPARI2在iNeurons中的功能。通过流式细胞术检测，发现CaMPARI2的R/G比值随光照时间（0-10分钟）延长而增加；谷氨酸刺激可诱导剂量依赖性的光转换增加；CRISPRi敲低已知的神经元活性调控因子TSC1或STXBP1可显著降低R/G比值。这些数据确立了CaMPARI2光转换作为流式细胞术兼容的神经元活性定量读出的可靠性。
**2. 基于CaMPARI2的CRISPRi筛选鉴定出TMEM50A为神经元活性的关键调控因子（A CaMPARI2-based CRISPRi screen uncovers known and previously uncharacterized neuronal activity regulators）**
通过筛选靶向64个记忆相关基因的sgRNA文库，研究人员鉴定出多个已知的神经元活性和癫痫相关基因（如ATP6V0C、HNRNPH2、NSF、STX1B等），验证了筛选策略的有效性。其中，TMEM50A作为一个功能未知的基因被优先关注。进一步验证实验表明，三个独立的sgRNA敲低TMEM50A均显著降低CaMPARI2信号；电生理记录显示TMEM50A缺陷iNeurons的微小兴奋性突触后电流（sEPSC）频率和幅度均显著降低，且动作电位发放数量减少，表明TMEM50A对维持兴奋性突触传递和内在兴奋性至关重要。
**3. TMEM50A定位于多泡体（TMEM50A localizes to multivesicular bodies）**
通过CRISPR-Cas9介导的内源标签敲入技术，研究人员在HEK293T细胞和iNeurons中观察到TMEM50A呈点状囊泡分布。共定位分析显示TMEM50A主要与内体标志物共定位，而非溶酶体。IP-MS鉴定的TMEM50A相互作用蛋白中，许多参与囊泡运输（如AP2复合物、RAB11B等）和ESCRT/MVB相关过程（如CHMP7、CHMP1B、CHMP4B、VTA1、HGS等）。基因本体分析进一步突出富集了MVB相关通路，且TMEM50A与MVB标志物CD63共定位，证实TMEM50A富集于MVBs上。
**4. TMEM50A与LEPROTL1形成复合物并与ESCRT-III互作以维持MVB功能（TMEM50A forms a complex with LEPROTL1 and interacts with ESCRT-III to maintain MVB function）**
IP-MS发现LEPROTL1是TMEM50A的重要相互作用蛋白。AlphaFold3结构预测显示人类TMEM50A-LEPROTL1复合物与其酵母同源物Vps68-Vps55结构高度相似。免疫共沉淀（co-IP）和免疫荧光实验证实了TMEM50A与LEPROTL1的相互作用和共定位。功能研究表明，LEPROTL1敲低与TMEM50A敲低对神经元活性的影响相似，双敲低未表现出叠加效应，表明两者在同一通路中发挥作用。此外，TMEM50A、LEPROTL1与ESCRT-III组分CHMP4B存在相互作用，且在MVBs上共定位。EGFR降解实验显示TMEM50A缺失显著延缓了EGFR的降解，表明MVB介导的货物降解功能受损。在体SEM分析显示Tmem50a-KO小鼠前扣带回皮层（ACC）中MVB内腔内囊泡（ILVs）数量显著减少。TMEM50A与LEPROTL1结合界面突变破坏了相互作用并损害了其功能，表明TMEM50A-LEPROTL1复合物对ESCRT依赖性ILV形成和MVB功能至关重要。
**5. TMEM50A缺失重塑神经元表面蛋白质组并降低突触密度（TMEM50A loss remodels neuron surface proteome and reduces synapse density）**
表面生物素化结合定量蛋白质组学分析显示，TMEM50A KO iNeurons的质膜蛋白广泛改变，富集分析突出细胞粘附、轴突导向和突触组织相关通路。免疫染色显示TMEM50A KO iNeurons中突触密度显著降低，而突触小点大小、树突数量和胞体大小无显著变化。在CRISPRi转基因小鼠原代皮层神经元中也验证了Tmem50a敲低导致突触密度显著降低。在体SEM分析进一步证实Tmem50a-KO小鼠ACC区域突触密度显著降低，而突触间隙宽度、囊泡数量和PSD长度等超微结构参数未受影响。
**6. Tmem50a缺失改变小鼠记忆和焦虑相关行为（Tmem50a loss alters memory- and anxiety-related behaviors in mice）**
行为学实验显示，在情境恐惧条件化范式中，Tmem50a-KO小鼠的近期记忆（第5天）与WT无异，但远期记忆（第21天）的冻结行为显著减少，表明远程记忆巩固受损。旷场实验显示Tmem50a-KO小鼠在中央区域停留时间显著增加，提示焦虑样行为减少，而总运动距离无差异。转棒实验未发现两组在运动协调和平衡能力上的差异。
**结论**
本论文开发了一种将CaMPARI2钙整合传感器与CRISPRi筛选相结合的高通量功能基因组学平台，能够在人类iPSC来源的神经元中进行混合遗传筛选，系统性地鉴定神经元活性调控因子。通过筛选记忆相关基因，研究人员鉴定出TMEM50A——一个此前功能未知的蛋白——作为神经元活性的关键调控因子。TMEM50A与LEPROTL1形成复合物，定位于多泡体（MVBs），并与ESCRT-III机制相关联，支持腔内囊泡形成和MVB介导的货物降解。TMEM50A缺失导致神经元表面蛋白质组广泛重塑、突触密度降低、突触传递和内在兴奋性受损，并在小鼠中引起远程记忆缺陷和焦虑样行为改变。该研究不仅建立了一个可扩展的神经元活性筛选平台，还揭示了TMEM50A依赖性MVB功能在维持突触完整性和行为中的关键作用，为理解神经元活性调控机制和相关神经系统疾病的病理机制提供了新的见解。
