《Cell Reports》：Intratelencephalic neurons in the medial prefrontal cortex mediate the acquisition of goal-directed actions
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内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）及其与后侧背内侧纹状体（posterior dorsomedial striatum, pDMS）的连接参与目标导向学习，但所涉及的具体mPFC细胞类型尚未明确。本研究探讨了mPFC
内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）及其与后侧背内侧纹状体（posterior dorsomedial striatum, pDMS）的连接参与目标导向学习，但所涉及的具体mPFC细胞类型尚未明确。本研究探讨了mPFC脑内投射（intratelencephalic, IT）神经元和锥体束（pyramidal tract, PT）神经元在目标导向学习中的作用。研究人员利用Cre-driver小鼠品系，绘制了从mPFC向背侧纹状体双侧投射的IT神经元和单侧投射的PT神经元图谱，并证明化学遗传学抑制IT而非PT神经元可减弱目标导向学习。研究人员随后证实，训练诱导IT神经元中磷酸化细胞外信号调节激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase, pERK）信号升高，该信号在mPFC浅层呈瞬时性，在深层则更为持续。这一变化与深层IT神经元的可塑性相关，表现为突触输入向兴奋性而非抑制性方向转变。综上所述，这些数据表明目标导向学习影响mPFC IT神经元的突触输入和下游可塑性标志物，且该影响在功能上有助于目标导向学习。
**内侧前额叶皮层脑内投射神经元在目标导向行为习得中的功能与机制**
**研究背景与科学问题**
目标导向行为的习得依赖于对动作-结果（action-outcome, A-O）关联的编码，这一过程在神经层面涉及前额叶-纹状体环路，即背内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC）与后侧背内侧纹状体（posterior dorsomedial striatum, pDMS）之间的连接。已有研究表明，mPFC在目标导向学习中发挥短期工作记忆作用，将特定的动作-结果关系整合并传递至pDMS进行长期编码。然而，既往研究虽观察到目标导向学习可增加mPFC中细胞活动标志物（如磷酸化细胞外信号调节激酶，pERK）的表达，且阻断ERK磷酸化可消除pDMS可塑性和目标导向学习，但mPFC中具体参与该过程的细胞类型尚未明确。皮层投射神经元主要分为两类：脑内投射（intratelencephalic, IT）神经元，分布于皮层第2-6层，双侧投射至皮层及皮层样结构（包括对侧皮层、基底外侧杏仁核、屏状核及纹状体）；锥体束（pyramidal tract, PT）神经元，局限于第5b层，同侧投射至丘脑、上丘和脑干等端脑外结构，同时发出侧支至纹状体。尽管IT和PT神经元在解剖学上的差异已被充分表征，但这两类细胞在目标导向行为中的功能贡献仍不清楚。因此，本研究旨在利用细胞类型特异性转基因小鼠品系，直接探究mPFC IT和PT神经元在目标导向学习中的功能作用及其潜在的突触和分子机制。
**研究方法概述**
研究人员利用细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）-Cre重组酶驱动小鼠品系，包括特异性标记IT神经元的KH288-Cre品系和特异性标记PT神经元的Sim1-KJ18-Cre品系，结合多种技术手段开展研究。主要方法包括：使用Cre依赖的顺行示踪病毒（AAV2/5-hSyn-FLEX-mGFP-2A-Synaptophysin-mRuby）进行神经元投射图谱绘制；采用化学遗传学方法（抑制性DREADD，即hM4D(Gi)）实现IT和PT神经元活动的可逆抑制；运用免疫荧光技术检测pERK表达以评估神经元活动；以及使用离体脑片全细胞膜片钳电生理记录检测微型兴奋性突触后电流（mEPSCs）和微型抑制性突触后电流（mIPSCs）。实验动物为成年（2-6月龄）雄性和雌性KH288-Cre和Sim1-Cre小鼠，均饲养于新南威尔士大学决策神经科学实验室。
**研究结果**
**1. mPFC IT和PT神经元至纹状体投射的示踪图谱**
研究人员将Cre依赖的顺行示踪病毒Flex-mGFP-Synaptophysin-mRuby单侧注射至KH288-Cre和Sim1-Cre小鼠的mPFC，分别标记IT和PT神经元及其下游突触接触。结果显示，KH288-Cre小鼠中mRuby颗粒密度在同侧和对侧半球无显著差异（F(1,14) = 0.90, p = 0.36），证实了IT神经元向纹状体的双侧投射。相反，Sim1-Cre小鼠表现出显著的偏向同侧投射（F(1,14) = 20.07, p = 0.001），证实PT神经元主要为同侧投射。在纹状体前部区域，IT神经元连接广泛，密集支配同侧和对侧纹状体的大片区域；在纹状体后部区域，连接密度集中于纹状体背侧——该区域已被证实对工具性条件反射至关重要。相比之下，PT神经元连接仅局限于同侧纹状体，且在前部和后部区域均呈稀疏分布，定位于背侧纹状体的更中央区域。
**2. 化学遗传学抑制mPFC IT而非PT神经元损害目标导向学习**
研究人员向KH288-Cre或Sim1-Cre小鼠的mPFC双侧注射Cre依赖的抑制性DREADD病毒（AAV5-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry）或对照病毒（AAV5-hSyn-DIO-mCherry），在工具性训练期间给予氯氮平-N-氧化物（Clozapine-N-Oxide, CNO）以诱导IT或PT神经元活动的持续抑制。行为学测试采用结果贬损后的选择消退测试评估目标导向行为。结果表明，在IT神经元抑制实验中，训练期间各组按压速率均增加（线性趋势，F(1,59) = 63.30, p < 0.001），组间无显著差异。但在测试中，对照组动物在测试早期对仍有价值杠杆的按压显著高于已贬损杠杆，随后在该杠杆上快速消退；而训练期间IT神经元受抑制的动物在测试中对两个杠杆维持相似的按压速率。统计分析显示组（对照组 vs. hM4D + CNO）× 贬损状态存在显著交互作用（Bonferroni, k = 2, F(1,59) = 8.84, p = 0.004），表明IT神经元抑制减弱了动作-结果关联的习得。相比之下，在PT神经元抑制实验中，所有组均表现出对结果贬损的敏感性（最低F(1,45) = 8.21, p = 0.006），抑制PT神经元未对目标导向学习产生显著影响。
**3. 早期目标导向学习增加mPFC IT神经元中pERK表达**
研究人员在KH288-Cre小鼠mPFC中通过DIO-mCherry标记IT神经元，将动物分为工具性训练组（按压杠杆获得食物颗粒）和配对对照组（yoked control，结果递送与按压无关），训练后5分钟或60分钟进行灌注以检测pERK表达。在20分钟训练期内，工具性训练组表现出明显的习得行为（F(1,30) = 62.09, p < 0.001）。定量分析显示，在L2/3层，工具性训练后5分钟时IT神经元中pERK共标记百分比显著增加（F(1,30) = 5.80, p = 0.022）；在L5/6层，工具性训练后60分钟时pERK共标记百分比显著增加（F(1,30) = 13.94, p = 0.001）。这一结果表明，相对于配对对照组，工具性训练首先在mPFC浅层IT神经元中瞬时升高pERK信号，随后在深层IT神经元中产生延迟或持续的pERK升高。
**4. 目标导向学习使IT神经元输入向兴奋性偏移**
在KH288-Cre小鼠mPFC中标记IT神经元后，动物接受单次工具性或配对训练，训练后4小时进行离体电生理记录。在L2/3层IT神经元中，工具性训练未引起mEPSCs或mIPSCs的频率和幅度显著变化（Fs < 2.38），兴奋-抑制比（E-I比）无组间差异（Fs < 1）。然而，在L5/6层IT神经元中，工具性训练显著增加了mEPSCs的频率（F(1,54) = 9.03, p = 0.004）但不影响幅度（F < 1.8），同时显著降低了mIPSCs的频率（F(1,54) = 6.77, p = 0.012）但不影响幅度（F < 1）。细胞内比较显示，L5/6 IT神经元的E-I比显著增强（F(1,54) = 23.87, p < 0.001）。这些结果表明，工具性训练与L5/6（而非L2/3）IT神经元中谷氨酸能输入增加和GABA能输入减少相关的全局性兴奋-抑制平衡偏移相关联。
**研究结论与意义**
本研究通过细胞类型特异性转基因小鼠品系，系统揭示了mPFC IT神经元在目标导向学习中的关键功能作用。研究发现：mPFC IT神经元向背侧纹状体（包括pDMS）发送密集的双侧投射，而PT神经元仅发送稀疏的同侧投射；化学遗传学抑制IT神经元而非PT神经元损害目标导向学习；早期学习诱导L2/3 IT神经元中pERK瞬时升高，而L5/6 IT神经元中pERK持续升高至少1小时；L5/6 IT神经元在早期学习后表现出兴奋性输入增加和抑制性输入减少的持续性突触变化。这些发现将先前在大鼠中观察到的双侧投射皮层纹状体神经元参与目标导向学习的证据扩展至特定细胞类型，确立了IT神经元（而非PT神经元）在此学习过程中的功能必要性。研究还揭示了IT神经元中学习诱导的突触输入平衡改变可能是其参与目标导向学习的潜在细胞机制。这些结果对于理解前额叶-纹状体环路在目标导向行为中的细胞特异性功能组织具有重要意义，为后续研究皮层内和长程输入如何驱动皮层纹状体通路在目标导向学习中的募集提供了基础。
