IL-19+ 单核细胞抑制神经炎症并促进年轻创伤性脑损伤患者的神经功能恢复

《Cell Reports》：IL-19+ monocytes suppress neuroinflammation and promote neurological recovery in young individuals with traumatic brain injury

　　

年轻创伤性脑损伤（TBI）患者预后优于老年患者，但其潜在机制尚不清楚。本研究中，研究人员鉴定了一群来源于颅骨骨髓的IL-19⁺单核细胞，在TBI后出现于脑内。IL-19⁺单核细胞通过IL-19/IL-20R轴抑制胶质细胞过度反应并促进TBI后神经功能恢复，而该轴在老年患者中存在缺陷。进一步研究证实，TBI后IL-19⁺单核细胞上的CX3CR1被CX3CL1吸引，浸润脑组织并发挥免疫调节作用。值得注意的是，脑室内注射重组CX3CL1通过增强颅骨IL-19⁺单核细胞向脑组织的输出，抑制过度神经炎症并促进老年TBI小鼠的神经功能恢复。该研究证明了颅骨骨髓在TBI后修复过程中的重要参与，并提示特征性募集颅骨骨髓来源的调节性髓系细胞可能是改善老年TBI预后的有效方法。

**论文解读：颅骨骨髓来源的IL-19⁺单核细胞在创伤性脑损伤后的年龄依赖性神经保护作用**

**研究背景与问题**
创伤性脑损伤（TBI）是神经外科常见急症，具有高致死率和致残率。临床观察表明，年轻TBI患者通常预后优于老年患者，但背后的生物学机制尚不明确。适度神经炎症有助于脑损伤后修复，但老年患者中出现的过度神经炎症却促进神经退行性变，导致不良结局。颅骨与脑在解剖上紧密相邻，过去颅骨被视为静态的保护结构，但近期研究揭示颅骨骨髓是中枢神经系统（CNS）髓系细胞的重要储库，并通过直接血管通道与脑表面相连，允许免疫细胞在损伤后迁移入脑。然而，颅骨在TBI后是加重还是缓解病理反应尚不清楚。因此，该研究旨在探索颅骨骨髓来源的免疫细胞在TBI后年龄依赖性差异预后的作用。

**研究内容与结论**
研究人员综合运用蛋白质组学、转录组学、单细胞转录组学及小鼠过继转移模型，鉴定了一群来源于颅骨骨髓的IL-19⁺单核细胞/巨噬细胞，在TBI后出现于脑内。这些细胞通过IL-19/IL-20R轴抑制胶质细胞过度反应，维持小胶质细胞和星形胶质细胞稳态。进一步研究发现，星形胶质细胞释放的CX3CL1通过CX3CL1-CX3CR1轴吸引这群免疫调节性IL-19⁺单核细胞浸润脑组织。老年星形胶质细胞CX3CL1释放受损是TBI后颅骨向脑输出IL-19⁺单核细胞不足的关键原因。脑室内注射重组CX3CL1（rCX3CL1）可恢复老年TBI小鼠颅骨来源IL-19⁺单核细胞向脑的输出，抑制过度神经炎症，显著改善神经功能恢复。该研究揭示了年龄依赖的TBI预后差异机制，并提示趋化因子介导的颅骨骨髓-脑对话调控可能是促进老年TBI患者神经修复的临床新策略。论文发表在《Cell Reports》。

**主要技术方法**
1. **临床样本来源**：收集年轻与老年TBI患者（去骨瓣减压术后）及面肌痉挛（HFS）对照患者的脑脊液（CSF）和颅骨骨髓标本。
2. **蛋白质组学分析**：采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行非靶向蛋白质组学，结合主成分分析（PCA）和基因集富集分析（GSEA）。
3. **单细胞RNA测序（scRNA-seq）**：使用10x Genomics平台对年轻和老年小鼠TBI后72h的脑组织进行单细胞转录组测序，鉴定细胞类型并分析IL-19表达。
4. **骨髓移植（BMT）策略**：通过体屏蔽颅骨照射（保护外周骨髓）或颅屏蔽全身照射（保护颅骨骨髓），结合GFP⁺供体细胞，追踪脑内IL-19⁺单核细胞的起源。
5. **基因敲除小鼠**：使用Il19、Il20ra、Cx3cr1、Cx3cl1基因敲除（KO）小鼠，结合细胞特异性腺相关病毒（AAV）介导的Il20ra敲低，验证信号通路功能。
6. **体外功能实验**：原代小胶质细胞和星形胶质细胞培养，采用LPS或IL-1α/TNF-α/C1q（TIC）刺激，加入IL-19⁺或IL-19^-单核细胞条件培养基，评估胶质细胞标志物表达。
7. **神经行为学评估**：采用改良神经功能评分（mNSS）、Morris水迷宫（MWM）、转棒实验和爬杆实验评估小鼠神经功能恢复。

**研究结果**
**1. IL-19在年轻TBI患者CSF中积累并与良好预后相关**
通过对年轻和老年TBI患者及HFS对照的CSF进行蛋白质组学分析，发现TBI后CSF中促炎因子（IL-1β、CXCL1、CXCL8、C3）上调，抗炎因子（IL-4、IL-10、TGF-β）及神经营养因子（BDNF、NGF）下调。年轻TBI患者CSF中IL-19显著升高，ELISA验证其浓度与出院格拉斯哥评分呈正相关，与住院时长呈负相关。小鼠CCI模型同样证实年轻TBI小鼠CSF中IL-19浓度高于老年小鼠，且与神经功能评分负相关。

**2. IL-19抑制神经炎症并促进TBI后神经功能恢复**
向老年TBI小鼠尾静脉注射重组IL-19（rIL-19）可抑制神经炎症（降低Nlrp3、Casp1、Il1b转录），减轻小胶质细胞过度反应和外周免疫细胞浸润，并加速神经功能恢复（mNSS评分降低，MWM逃逸潜伏期缩短）。在年轻TBI小鼠中注射IL-19中和抗体（αIL-19）则加重神经炎症，恶化神经功能。Il19-KO年轻TBI小鼠的转录组与老年TBI小鼠相似，炎症相关通路富集，神经损伤修复通路下调；MWM测试显示Il19-KO年轻小鼠神经功能恢复显著差于野生型年轻小鼠，与老年小鼠相当。补充rIL-19可逆转Il19-KO小鼠的神经炎症和功能缺陷。

**3. TBI后脑内浸润的IL-19⁺单核细胞/巨噬细胞主要来源于颅骨骨髓**
scRNA-seq显示IL-19在TBI后仅表达于单核细胞/巨噬细胞，年轻小鼠中IL-19⁺细胞远多于老年小鼠。流式细胞术证实IL-19⁺细胞主要为单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs），而非小胶质细胞。比较颅骨骨髓、股骨骨髓和脑组织的单核细胞/巨噬细胞转录组，PCA显示颅骨骨髓与脑组织的细胞转录特征一致，而股骨骨髓细胞不同。体屏蔽颅骨照射BMT实验表明，86.7%的脑内IL-19⁺单核细胞/巨噬细胞为供体来源（颅骨骨髓），仅1.47%为宿主来源（外周骨髓）；颅屏蔽全身照射BMT实验进一步证实绝大多数IL-19⁺细胞为宿主来源（颅骨骨髓）。

**4. IL-19⁺单核细胞/巨噬细胞主要通过IL-19/IL-20R轴发挥免疫调节功能**
无监督聚类将小胶质细胞分为6个亚群，老年TBI小鼠促炎性小胶质细胞比例显著增加，而年轻TBI小鼠吞噬性小胶质细胞比例更高。星形胶质细胞也分为6个亚群，老年小鼠促炎和早期活化亚群占比更高。Il20ra和Il20rb（编码IL-19受体IL-20R）在小胶质细胞和星形胶质细胞中与活化标志物Fos共定位。细胞间通讯分析显示年轻TBI小鼠中单核细胞/巨噬细胞与小胶质细胞和星形胶质细胞之间的Il19-Il20ra/Il20rb信号增强。体外实验表明，IL-19⁺单核细胞条件培养基可恢复LPS刺激的小胶质细胞稳态标志物P2ry12，抑制反应性标志物Cd86、Cd163；在TIC刺激的星形胶质细胞中恢复稳态标志物Slc6a11，抑制C3、Emp1。这些效应可被αIL-19或Il20ra敲低消除。人小胶质细胞系HMC3和人星形胶质细胞系HA中IL20RA敲低后，炎症反应加重。

**5. IL-19⁺单核细胞/巨噬细胞通过IL-19/IL-20R轴抑制TBI后过度胶质反应并促进神经功能恢复**
将FACS分选的颅骨骨髓来源IL-19⁺或IL-19^-单核细胞过继转移至经氯膦酸脂质体（Clo-Lip）预处理（清除单核细胞）的年轻或老年小鼠颅骨内，随后进行TBI建模。与接受IL-19^-单核细胞的老年TBI小鼠相比，接受IL-19⁺单核细胞的小鼠脑内炎症性胶质细胞标志物转录降低，稳态标志物恢复，免疫荧光显示水肿区TMEM119⁺CD86⁺小胶质细胞和GFAP⁺C3⁺星形胶质细胞比例减少，且mNSS评分和爬杆时间显著改善。Il20ra全身敲除可阻断IL-19⁺单核细胞的保护作用，而脑内注射细胞特异性AAV敲低小胶质细胞或星形胶质细胞的Il20ra同样消除其神经保护效果，并增加CSF中促炎因子IL-1β、IL-6水平，降低TGF-β1水平。

**6. IL-19⁺单核细胞通过CX3CR1/CX3CL1轴迁移至脑**
蛋白质组学发现年轻TBI患者CSF中CX3CL1高表达，ELISA验证其显著上调。IL-19⁺单核细胞转录组中Cx3cr1高度表达，流式细胞术证实TBI后单核细胞CX3CR1表达上调，年轻小鼠更显著。年轻TBI患者颅骨骨髓中CX3CR1⁺单核细胞比例更高，其中非经典单核细胞CX3CR1平均荧光强度（MFI）更高。Transwell实验显示rCX3CL1剂量依赖性地吸引颅骨骨髓单核细胞，且迁移细胞几乎均为IL-19⁺。Cx3cr1-KO小鼠TBI后颅骨骨髓中IL-19⁺单核细胞积累增加，脑内数量减少；过继转移Cx3cr1-KO单核细胞同样导致脑内浸润减少。CX3CL1主要来源于星形胶质细胞，TBI后年轻星形胶质细胞中CX3CL1表达增强更显著。

**7. 脑室内注射rCX3CL1改善老年TBI小鼠预后**
给老年TBI小鼠脑室内注射rCX3CL1可增加颅骨IL-19⁺单核细胞向脑的输出，减少脑内炎症性小胶质细胞和星形胶质细胞比例。转录组分析显示rCX3CL1处理后老年小鼠的脑转录组与年轻小鼠更接近，炎症相关通路下调，神经损伤修复通路（如“神经元突触可塑性”“伤口愈合”）富集。行为学测试表明rCX3CL1处理组mNSS评分更低，MWM逃逸潜伏期缩短，转棒跌落潜伏期延长。通过Cx3cr1-KO小鼠排除CX3CL1直接作用于小胶质细胞CX3CR1的可能性，进一步证实rCX3CL1的治疗效果主要依赖于颅骨骨髓中IL-19⁺单核细胞的募集。

**总结讨论与结论**
该研究揭示了TBI后年龄依赖性预后差异的机制：年轻个体中，星形胶质细胞释放CX3CL1，通过CX3CL1-CX3CR1轴吸引颅骨骨髓来源的IL-19⁺单核细胞浸润脑组织，这些细胞通过IL-19/IL-20R轴抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的过度活化，维持神经稳态，促进神经功能恢复。老年个体中，CX3CL1释放减少导致IL-19⁺单核细胞输出不足，从而引发过度神经炎症和不良预后。脑室内补充rCX3CL1可逆转这一缺陷，改善老年小鼠的神经功能。研究还指出，IL-19⁺单核细胞同时表达CCR2，与经典的CCR2-CCL2促炎性单核细胞募集轴形成平衡，年龄相关失衡加剧了病理过程。此外，IL-19作为淋巴管生成因子可能通过维持脑膜淋巴管功能进一步促进神经炎症消退。研究结论表明，年龄相关机制是TBI预后差异的关键，脑室内输注rCX3CL1可能成为老年TBI患者的有效治疗策略。