TIGRa：一种实现多重高效基因调控的超紧凑可编程激活器

《Cell Stem Cell》：TIGRa: An ultra-compact programmable activator enabling multiplexed and efficient gene regulation

　　

程序性基因激活具有广泛的治疗潜力，但一直受到大尺寸效应器、有限的多重化能力以及体内递送挑战的制约。在此，研究人员开发了TIGR-TasR介导的激活器（TIGRa），一种源自串联间隔向导RNA（TIGR）-TIGR相关蛋白（TasR）系统的紧凑型转录激活器，其机制与基于CRISPR的激活器截然不同。TIGRa的尺寸不到基于dSpCas9激活器的一半，同时实现相当或更高的激活效率。其天然TIGR阵列架构能够实现高效的多重化调控，支持从单个紧凑构建体中同时激活多达12个内源基因。TIGRa介导的多基因激活高效地将人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞。此外，一种全合一腺相关病毒（AAV）-TIGRa载体在体内激活了内源CaMKII，在N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的视网膜损伤小鼠模型中促进视网膜神经节细胞存活并保留视觉功能。这些结果确立了TIGRa作为一种用于治疗性基因调控和体内基因医学的紧凑且可多重化的平台。

**TIGRa：一种实现多重高效基因调控的超紧凑可编程激活器——论文深度解读**

**一、研究背景与科学问题**

视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）的变性是青光眼、外伤性视神经损伤等多种视神经病变导致视力丧失的根本原因，而目前有效的神经保护疗法十分有限。越来越多的证据表明，同时调控多个生存与再生通路，而非单一基因干预，是实现RGCs及其轴突持久功能保护所必需的。程序性转录激活技术提供了一种协同上调参与神经元存活与修复的内源基因网络的潜在策略。其中，基于CRISPR的激活器（CRISPRa）通常以核酸酶失活的SpCas9（dSpCas9）融合转录激活结构域（如VP64-p65-Rta, VPR）为核心，通过向导RNA引导至转录起始位点附近的调控区域实现靶向基因激活。尽管CRISPRa已在神经和视网膜疾病模型中实现了单个基因的体内激活，但将其拓展至稳健、协调的多基因激活仍面临重大转化挑战。

限制多重基因激活治疗性应用的关键障碍在于体内递送限制。腺相关病毒（AAV）载体因其良好的安全性、组织嗜性和持续的转基因表达，是目前眼科和中枢神经系统适应症中最临床先进且广泛使用的基因递送平台。然而，标准AAV载体约4.7-kb的包装容量对基因调控元件的尺寸和复杂性施加了严格限制。基于dSpCas9的经典激活器（1,368个氨基酸）超过此限制，无法实现单载体递送。尽管dCas12a（1,228 aa）能加工自身的CRISPR RNA（crRNA）阵列以支持多重化，但其大尺寸同样需要复杂的双AAV策略，给剂量控制、共转导效率和临床转化带来困难。相反，近期开发的紧凑型平台如dCasMINI（529 aa）虽兼容单AAV递送，但缺乏利用天然向导RNA阵列的能力，限制了从单一构建体进行可扩展的多基因激活。这些限制共同制约了多重转录激活在体内、尤其是在需要协调调控多个疾病相关基因的治疗场景中的应用。

**二、研究内容与主要结论**

针对上述挑战，研究人员系统地评估了基于核酸酶失活的微型RNA引导核酸酶的转录激活器，并鉴定出死亡副杆菌属TasR（dParTasR），一种仅需36-nt tigRNA的紧凑型组成型二聚体RNA引导核酸酶，作为基因激活的稳健支架。通过整合优化的紧凑型激活结构域和精炼DNA结合模块，研究人员工程化了一系列具有增强效力和最小尺寸的激活器，最终开发出TIGR-dTasR介导的激活器（TIGRa）平台。TIGRa独特地结合了内在小型化与天然tigRNA阵列介导的多重化能力，克服了现有CRISPRa系统的大尺寸效应器和低效多重化两大主要局限，实现了从单个AAV载体协调激活多个内源基因。

研究人员首先通过比较九种微型RNA引导核酸酶-VPR激活器在HBB位点的激活效率，发现dParTasR-VPR（即TIGRa）实现了高达7,486倍的诱导，与最佳dCasMINI-VPR阳性对照（8,676倍）相当。进一步分析24个tigRNA靶位点显示，TIGRa激活了83%的位点，最大激活倍数达36,782倍。与四种代表性CRISPRa系统（dCasMINI、dCas12a、hyperdCas12a和dSpCas9）在四个基因位点的头对头比较中，TIGRa达到了与最高效的dSpCas9系统相当的水平，并超越其他三种激活器2.45至3.55倍。

为增强性能，研究人员工程化了TIGRa变体。通过评估四种先前报道的微型转录激活结构域（miniTADs），确定NFZ（145 aa）在保持与VPR相当激活效率的同时尺寸大幅减小，命名为TIGRa-Mini（540 aa）。进一步将NFZ与p65（P）融合，产生TIGRa-Pro（727 aa），激活效率较VPR提高约3至5倍。通过融合辅助DNA结合结构域（DBD）Aho7c（60 aa），研究人员构建了TIGRa-Ultra，实现了最高激活效率，为原始TIGRa的3.99倍。全转录组RNA测序（RNA-seq）分析证实，所有TIGRa变体均选择性上调预期靶基因，同时保持相对受限的转录组扰动，特异性与dCasMINI-VPR相当。

在多重化能力方面，研究人员比较了五种多tigRNA阵列架构，发现天然TIGR阵列（TA）架构（Multi1）表现出最强激活，且仅414 bp，约为传统U6启动子驱动四tigRNA构建体（Multi5）的三分之一。小RNA测序证实天然TA可有效加工为成熟的36-nt tigRNA。利用TA6阵列，TIGRa在六个基因上均实现强效激活，平均超越各基因最佳单tigRNA 2.98倍，实现了无需筛选的基因激活。在极限测试中，包含12个tigRNA的TA12阵列使TIGRa-Pro同时强效上调全部12个靶基因，平均激活水平比12个单独表达tigRNA的混合物高4.11倍。

在治疗相关位点的基准测试中，TIGRa-Pro在PDE6B、OPN1MW、LAMA1、SIM1、MC4R和FGF21等位点均达到超越或媲美先前报道的最佳CRISPRa系统的激活水平。特别地，在激活OCT4、SOX2和KLF4（OSK）基因时，TIGRa在OCT4位点显著优于hyperdCas12a（10,805倍对5,007倍）。

作为概念验证，研究人员设计了双载体TIGRa系统（表达TIGRa-Ultra的载体和含七个U6驱动tigRNA的紧凑TA载体），成功将人成纤维细胞（HFs）重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），效率（0.0089%）与常规四载体dCas9-VP192系统（0.0085%）相当。重编程的iPSCs表达核心多能性标志物，并能在体内形成包含三胚层衍生物的畸胎瘤。

最后，研究人员构建了单AAV载体（AAV-TIGRa-Pro-U6-CaMKII，总计4.0 kb），包装TIGRa-Pro和靶向CaMKIIa/CaMKIIb的TA阵列。在N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的视网膜损伤小鼠模型中，AAV-TIGRa使CaMKIIa和CaMKIIb RNA水平分别提高2.1倍和1.5倍，总CaMKII蛋白丰度提高1.4倍，RGC转导率达87%。AAV-TIGRa处理使RGC存活数量增加2.1倍，视网膜神经节细胞复合体（GCC）厚度增加1.3倍，PERG振幅提高2.7倍，视敏度提高2.2倍，且在治疗4个月后未观察到明显的视网膜炎症或长期毒性。

**三、关键技术方法**

本研究应用了以下关键技术方法：1）基于核酸酶失活微型RNA引导核酸酶的转录激活器系统筛选与工程化，涉及VPR、NFZ、NFZP等激活结构域和Sso7d、Aho7c等DNA结合结构域的融合优化；2）利用逆转录定量PCR（qPCR）和全转录组RNA测序（RNA-seq）评估激活效率与转录组特异性；3）小RNA测序（small RNA-seq）分析TIGR阵列的加工产物；4）人成纤维细胞电穿孔重编程为iPSC及畸胎瘤形成实验验证多能性；5）采用AAV2.NN血清型载体进行玻璃体腔注射，结合光学相干断层扫描（OCT）、模式视网膜电图（PERG）和视动反应（OKR）评估体内效果。实验涉及HEK293T、N2a细胞系、人成纤维细胞以及C57BL/6J和NSG小鼠模型。

**四、研究结论与意义**

TIGRa代表了一种紧凑且天然可多重化的转录激活方法，直接解决了现有CRISPRa技术的关键递送和可扩展性挑战。通过在临床相关载体框架内实现内源基因网络的协调调控，TIGRa为开发针对需要多基因调控的复杂疾病（如神经退行性疾病、代谢性疾病、心血管疾病及其他多基因疾病）的基因激活策略奠定了基础。该平台在RGC保护中的应用展示了其在严格的递送限制下进行高效多基因激活的独特优势，为体内基因医学提供了新的可能。TIGRa的紧凑性使其能够适应单AAV载体的包装限制，而其天然TIGR阵列架构则实现了此前难以达到的多重化水平，这些特性共同确立了TIGRa作为一种可扩展且具有治疗相关性的体内基因调控策略的地位。