BAX/BAK凋亡检查点监控治疗诱导的衰老

《Cell Chemical Biology》：The BAX/BAK apoptotic checkpoint polices entry to therapy-induced senescence

　　

研究意义：DNA损伤化疗旨在消除恶性细胞，然而许多受损细胞通过进入治疗诱导衰老（therapy-induced senescence）存活，这是一种持续性的促炎状态，可促进肿瘤进展、治疗耐药和疾病复发。尽管凋亡和衰老是基因毒性应激的两种主要结果，但控制这些不同细胞命运选择的分子机制仍不完全清楚。定义调控这一决定的通路不仅对理解细胞对应激的反应至关重要，也对制定提高癌症治疗效果的策略具有重要意义。在此，研究人员鉴定出由BAX和BAK调控的线粒体凋亡检查点（mitochondrial apoptotic checkpoint）是进入治疗诱导衰老的核心调控者。研究人员表明，抑制BAX/BAK依赖的线粒体通透化（mitochondrial permeabilization）是DNA损伤后有效进入衰老所必需的。进入衰老的细胞通过增加促存活Bcl-2家族蛋白Bcl-xL和Mcl-1的表达来实现，这些蛋白抑制BAX/BAK的激活，尽管BH3-only蛋白Noxa、Bid和Puma持续诱导。因此，衰老细胞对Bcl-xL和Mcl-1的持续存活产生了明显的依赖性，从而创造了可被治疗利用的脆弱性。这些发现揭示了治疗诱导衰老不仅仅是避免凋亡的结果，而是反映了调控细胞死亡的同一线粒体调控网络的主动参与。更广泛地说，这项工作确立了Bcl-2家族网络作为凋亡-衰老命运决定的关键调控者，并鉴定出线粒体凋亡检查点作为细胞对基因毒性应激反应的决定因素。通过揭示伴随衰老的生存依赖性，这些发现还提出了限制化疗期间促肿瘤衰老细胞积累并改善治疗反应的策略。

**论文解读：BAX/BAK凋亡检查点监控治疗诱导的衰老**

**研究背景与问题**

DNA损伤化疗旨在消除恶性细胞，但许多受损细胞通过进入一种称为治疗诱导衰老（therapy-induced senescence）的持久性、促炎性细胞状态而存活下来。这种状态与肿瘤进展、治疗耐药和疾病复发密切相关。尽管凋亡和衰老是细胞应对基因毒性应激的两种主要结局，但调控细胞在这两种命运之间做出选择的分子机制仍不完全清楚。阐明这一决定过程的通路对于理解细胞应激反应以及开发提高癌症治疗效果的新策略至关重要。此前的研究表明，衰老细胞对某些凋亡诱导刺激具有抵抗性，但对被称为“衰老溶解剂”（senolytics）的特定化合物（如靶向Bcl-xL的BH3模拟物）表现出选择性敏感性。然而，BAX/BAK通道在监控衰老进入中的直接功能作用，以及BH3-only蛋白在影响衰老进入中的作用，尚未得到直接探索。因此，研究人员开展了本研究，旨在探讨BAX/BAK通道在调控化疗药物诱导衰老中的作用，以及促存活Bcl-2家族蛋白与促凋亡BH3-only蛋白在衰老细胞中的相互作用。该论文发表在《Cell Chemical Biology》。

**主要技术方法**

研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在HeLa、HCT116、A549和MCF-7人类癌细胞系中构建了BAX、BAK、Bcl-xL、Mcl-1、Bcl-2以及BH3-only蛋白（Noxa、Bid、Bim、Puma）的单基因或双基因敲除细胞系。通过瞬时（3小时）脉冲处理或连续处理的方式，使用顺铂（cisplatin）、依托泊苷（etoposide）、多柔比星（doxorubicin）和柔红霉素（daunorubicin）等DNA损伤化疗药物诱导衰老。利用免疫印迹（western blot）、免疫荧光共聚焦显微镜、酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法，检测衰老标志物（如p21、p16、γH2AX、Lamin B1、β-半乳糖苷酶）、细胞因子分泌（SASP相关因子）、BAX/BAK活性状态、细胞色素c释放以及线粒体形态。此外，使用BH3模拟物（Venetoclax、AZD-5991）和靶向蛋白降解嵌合体（PROTAC）进行药物干预，并评估细胞死亡和衰老率。

**研究结果**

**¹ BAX和BAK调控治疗诱导衰老的进入**
通过比较野生型与BAX/BAK双敲除（BAX/BAK^-/-）细胞对多种DNA损伤药物的反应，研究人员发现BAX/BAK缺失显著增强了细胞进入衰老的比例（超过2倍），并延长了衰老细胞的存活时间（从2-3周延长至4-5周）。这表明BAX/BAK线粒体检查点对衰老进入起着关键的监控作用。

**² 衰老细胞中BAX和BAK主要处于非活性状态**
免疫染色显示，大多数衰老细胞中BAX和BAK未检测到激活构象，细胞色素c主要保留在线粒体内，表明BAX/BAK依赖的线粒体外膜通透化（MOMP）未发生。然而，当用BH3模拟物处理衰老细胞时，可迅速诱导BAX/BAK激活和细胞色素c释放，导致衰老细胞死亡（senolysis）。这表明衰老细胞通过抑制BAX/BAK激活来维持存活。

**³ Bcl-xL和/或Mcl-1在衰老细胞中高度上调**
通过免疫印迹和免疫荧光分析，研究人员发现进入衰老的细胞中Bcl-xL和Mcl-1（在较小程度上）表达显著上调，而Bcl-2表达水平不变。同时，BH3-only蛋白Noxa、Bid和Puma也持续上调。这表明衰老细胞通过上调促存活蛋白来对抗DNA损伤诱导的促凋亡信号。

**⁴ 沉默或缺失Bcl-xL或Mcl-1大幅减少衰老进入**
通过siRNA敲低或CRISPR敲除Bcl-xL或Mcl-1，显著增强了DNA损伤诱导的细胞死亡，并极大减少了衰老细胞的比例。Bcl-xL或Mcl-1缺失的细胞在DNA损伤后表现出广泛的线粒体碎片化、BAX/BAK激活和细胞色素c释放。这证实了Bcl-xL和Mcl-1在抑制BAX/BAK激活和促进衰老进入中的关键作用。

**⁵ 缺失促凋亡BH3-only蛋白增强衰老进入**
在HeLa、HCT116和A549细胞中敲除NOXA或BID，显著提高了细胞在DNA损伤后进入衰老的比例，而敲除BIM或PUMA则效果不明显。更重要的是，在Bcl-xL敲除细胞中同时敲除NOXA或BID，能够部分恢复这些细胞进入衰老的能力。这表明DNA损伤诱导的BH3-only蛋白（尤其是Noxa和Bid）是限制衰老进入的主要促凋亡因素，而Bcl-xL通过抑制这些蛋白来促进衰老。

**⁶ 靶向降解Bcl-xL抑制衰老进入**
使用Bcl-xL靶向PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）或Mcl-1抑制剂AZD-5991，在DNA损伤处理的同时或之后处理细胞，能够显著增强BAX/BAK激活、细胞色素c释放和细胞死亡，从而大幅抑制衰老进入。这种效应在BAX/BAK敲除细胞中消失，证实其依赖于BAX/BAK。此外，NOXA或BID敲除的细胞对Bcl-xL降解的杀伤作用具有抗性，进一步证实了BH3-only蛋白在介导衰老细胞对Bcl-xL依赖性中的作用。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究揭示了在基因毒性应激下，细胞通过上调促存活Bcl-2家族蛋白（Bcl-xL和/或Mcl-1）来功能性抑制BAX/BAK通道，从而进入衰老状态。同时，DNA损伤诱导的BH3-only蛋白（如Noxa、Bid、Puma）使衰老细胞处于“促凋亡应激”状态，导致其对Bcl-xL和/或Mcl-1产生成瘾性，这解释了衰老细胞对BH3模拟物的脆弱性。研究还讨论了线粒体预处理（mitochondrial priming）的复杂性，以及Bcl-2家族蛋白抑制MOMP的两种模式（Mode 1和Mode 2），并提出衰老细胞可能更倾向于通过Mode 2方式存活。此外，研究指出BAX/BAK依赖的线粒体DNA释放可能通过cGAS/STING通路促进SASP。

结论部分翻译如下：研究人员在此表明，细胞在应对基因毒性应激时，可通过扰动Bcl-2家族网络中促存活和促凋亡成员的相对表达水平，抑制BAX/BAK激活，从而进入衰老状态。由于化疗应激诱导的BH3-only蛋白上调，衰老细胞变得对一种或多种促存活Bcl-2家族蛋白产生成瘾性，以抑制BAX/BAK通道的开放并维持衰老状态。因此，通过蛋白降解靶向嵌合体靶向降解Bcl-xL，或中和Mcl-1，可通过促进BAX/BAK激活极大地抑制治疗诱导衰老的进入。因此，除了已确立的调控细胞死亡的作用外，扩展的Bcl-2家族成员在调控治疗诱导衰老的进入中也发挥着关键作用。