重建与PAM相互作用的结构域以实现更广泛的PAM兼容性

《Genome Biology》：Reconstruction of PAM-interacting domains to broad PAM compatibility

　　

摘要

原间隔区相邻基序（PAM）的要求限制了CRISPR-Cas9的靶向能力。在此，我们开发了REPAM这一基于祖先序列重建的策略，通过重新设计与PAM相互作用的结构域来扩展PAM的识别范围。REPAM将Nme1Cas9和Nme2Cas9的PAM特异性从N4GATT/N4CC扩展到N4CNH，而进一步的突变则使Nme2Cas9的识别范围扩展到N4VHH。当应用于SpaCas9时，REPAM将PAM的兼容性从NNGYRA扩展到NNHH，从而使理论上的靶向覆盖范围增加约36倍。经过工程改造的SpaCas9在HEK293T细胞中的编辑效率可达76.6%，表现优于SpRY。相应的碱基编辑器能够高效生成保护性变异及精确的剪接位点突变，这凸显了REPAM作为CRISPR工程化工具的强大潜力。