《Stem Cell Research & Therapy》：A single-donor proof-of-concept single-cell analysis maps heterogeneous differentiation trajectories toward cartilage-like states in human urine-derived stem cells
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背景：尿源性干细胞（USCs）是一种可获取且非侵入性的细胞来源，已被报道具有软骨分化潜能。然而，研究人员对USC分化背后的细胞异质性和转录动力学仍不完全了解，这限制了其转化应用的解读。方法：研究人员将功能性分化实验与单细胞RNA测序（scRNA-seq）相结合
背景：尿源性干细胞（USCs）是一种可获取且非侵入性的细胞来源，已被报道具有软骨分化潜能。然而，研究人员对USC分化背后的细胞异质性和转录动力学仍不完全了解，这限制了其转化应用的解读。方法：研究人员将功能性分化实验与单细胞RNA测序（scRNA-seq）相结合，在表型和转录水平上表征USC分化。采用组织学染色、定量PCR（qPCR）和三维球体培养评估软骨形成和成骨分化。对未分化和分化的USC整合数据集进行单细胞转录组分析，随后进行伪时间轨迹推断，并映射到人类软骨参考图谱。结果：软骨诱导导致可重复地获得软骨相关特征，包括富含糖胺聚糖的细胞外基质沉积、SOX9表达增加，以及聚集蛋白聚糖（aggrecan）阳性球体的形成。在该供体中，单细胞分析描绘了一条从增殖状态向分化群体的推断分化轨迹，尽管精细的伪时间排序对分析选择敏感，因此仅作定性解读。沿此推断轨迹，研究人员识别出一个候选的瞬时转录状态，其特征为CDH1表达升高和上皮样聚集特征。向人类软骨参考图谱的概率映射显示，总体映射置信度较低（中位预测分数0.34），仅少数细胞与成熟/关节软骨相关参考状态表现出可靠的转录相似性（预测分数≥0.5，占所有细胞的7.8%和软骨诱导细胞的17.6%）。这种可靠的相似性集中在轨迹分化末端的少数几个簇中，而非代表培养物主体，且标签转移置信度并不等同于软骨细胞身份。尽管存在这种富集，分化群体仍表现出转录异质性，包括与肥大型、纤维软骨样和收缩型基因程序相关的细胞亚群，表明存在多条分化轨迹。结论：这项单供体概念验证研究表明，USC分化可能涉及一个候选的瞬时、聚集相关转录状态，伴随CDH1表达，并产生异质性谱系相关结局，仅少数细胞获得与成熟软骨的可靠转录相似性。由于这些观察结果来自单个供体，应将其视为产生假设的发现，并在得出供体非依赖性或转化性结论之前，需要在独立供体中进行验证。尽管如此，这些发现为未来多供体验证USC分化及其固有转录异质性提供了单细胞分辨率框架。
**研究背景与问题**
人类软骨发育及其在骨骼疾病中的失调机制研究仍面临重大挑战，主要原因是原代人软骨组织的可及性有限。传统研究常依赖间充质干细胞（MSCs）或诱导多能干细胞（iPSCs），但这些方法需要侵入性采样或复杂的重编程过程，且可能无法完全再现生理分化过程。尿源性干细胞（USCs）因其非侵入性获取和强大的扩增能力而成为有吸引力的细胞来源，已有研究报道其具有多谱系分化潜能，包括软骨分化。然而，培养的USC的细胞组成及其分化背后的转录程序仍不完全清楚，尤其是USC来源细胞是否遵循结构化的分化轨迹，以及它们在多大程度上类似于定义的软骨相关转录状态。此外，个体间USC组成和分化潜能的变异性已被报道，强调了对单个样本研究结果需谨慎解读。近年来单细胞RNA测序（scRNA-seq）的进展使得能够高分辨率解析细胞异质性和谱系进程，但尚未系统应用于USC软骨形成研究。此外，转化潜能依赖于临床兼容的培养条件，传统含胎牛血清（FBS）的培养基限制了可重复性和临床适用性，基于自体人血清（HS）的无异源成分培养系统是潜在替代方案，但其对USC分化轨迹和转录状态的影响尚不充分。为此，研究人员开展了一项单供体概念验证的单细胞分析，结合功能性分化实验，以定义该供体中培养USC的细胞异质性，推断候选分化轨迹，评估其与软骨相关状态的转录关系，并探究无异源成分培养条件对分化结局的影响。
**研究内容与结论**
研究人员通过功能实验（组织学染色、qPCR、三维球体培养）证实USC在软骨诱导条件下可重复获得软骨相关特征（如GAG沉积、SOX9上调、aggrecan阳性基质）。结合scRNA-seq整合分析，发现培养的未分化USC构成异质性上皮来源群体，包含增殖、上皮相关和基质/收缩型转录状态。伪时间轨迹推断（基于Slingshot）揭示了一条从增殖状态向分化状态的连续轨迹，并在轨迹中期识别出一个候选瞬时转录状态，其特征为CDH1（E-cadherin）表达升高，伴随上皮样聚集行为，免疫荧光在三个供体中验证了该蛋白水平的聚集相关表达。将整合USC数据集映射到人类软骨参考图谱（来自Huang等数据集，6个正常软骨样本）后，发现总体映射置信度低（中位预测分数0.34），仅7.8%所有细胞（17.6%软骨诱导细胞）以≥0.5的预测分数与成熟/关节软骨状态可靠相似，且这种相似性集中在轨迹末端少数簇中。进一步分析揭示分化群体中存在异质性谱系相关程序，包括肥大型、纤维软骨样和收缩型平滑肌相关基因程序，表明存在多条分化轨迹。无异源成分（HS）条件下，SOX9和CDH1表达升高，聚集增强，但GAG沉积减少，提示血清成分可调节分化相关基因表达和细胞行为。
**关键技术方法**
本研究采用的主要关键技术包括：①功能性分化实验（组织学染色、qPCR、三维球体培养及免疫荧光）评估软骨和成骨分化；②单细胞RNA测序（Parse Biosciences Evercode WT v3工作流程）对未分化和软骨诱导USC进行转录组分析；③伪时间轨迹推断（Slingshot）结合上皮亚群重整合分析；④概率映射至人类软骨参考图谱（整合6个正常软骨样本的公开scRNA-seq数据，来自Huang等数据集）；⑤模块评分（AddModuleScore）和CytoTRACE2评估发育潜能。样本来源为单供体，无异源成分实验采用自体人血清。
**研究结果**
1. **培养的uUSC构成异质性上皮来源群体，具有不同的增殖和谱系相关转录程序**
- 通过scRNA-seq（17710个细胞）和模块评分（基于肾上皮/壁层上皮细胞、近端小管样、远曲小管、厚升支样、尿路上皮、基质成纤维细胞样、平滑肌/收缩型和增殖程序），发现培养的未分化USC以上皮相关群体为主，同时存在增殖亚群（高TOP2A、MKI67）和基质/收缩型亚群（COL1A1、ACTA2等）。CytoTRACE2显示高发育潜能与增殖簇相关。
2. **USC在靶向功能实验中表现出可重复的谱系相关分化特征**
- 软骨诱导后，Alcian蓝染色阳性（GAG沉积）、SOX9 mRNA表达升高（qPCR，p<0.01）、bulk RNA-seq显示软骨相关基因（SOX9、SOX5、SOX6、COL2A1等）上调，三维球体形成aggrecan阳性基质（免疫荧光）。成骨诱导后Alizarin红阳性且SPP1表达升高（p<0.0001）。
3. **USC分化中存在一个候选的瞬时CDH1相关中间状态**
- 整合scRNA-seq分析（uUSC和chUSC）生成连续转录景观，伪时间轨迹（排除非上皮簇后重整合）从增殖簇起始，沿轨迹发现TOP2A下降，CDH1在早期峰值后下降（峰值/晚期比值约4.5倍，Spearman ρ≈-0.22），表明候选瞬时行为。免疫荧光显示三个供体软骨诱导5天后，聚集细胞结构具有突出的E-cadherin膜染色。
4. **仅少数软骨诱导的USC可靠映射至人类软骨参考图谱中的成熟软骨状态**
- 映射至Huang等数据集（6个正常软骨样本）的软骨参考图谱，总体预测分数中位数0.34，仅7.8%所有细胞（17.6% chUSC、2.5% uUSC）以≥0.5的分数对成熟/关节软骨状态可靠相似，且集中在末端簇。标签转移置信度不等于软骨细胞身份（如类神经元簇也高置信度映射）。
5. **分化USC表现出异质性谱系相关程序，包括肥大型、纤维软骨样和收缩型状态**
- 模块评分显示肥大型、纤维软骨样和收缩型平滑肌相关基因程序在特定分化簇中富集，且非均匀共表达，表明存在多条分化轨迹（如肥大型、纤维软骨样、收缩型）。
6. **人血清条件调节USC分化相关基因表达和聚集行为**
- 探索性分析显示，HS条件下Alcian蓝染色减弱（GAG沉积减少），但SOX9和CDH1 mRNA表达升高，细胞聚集增强，提示血清成分影响分化表型。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究结合功能实验和单细胞转录组学，以细胞分辨率解析了USC分化行为，表明USC分化是一个连续且异质的过程，涉及一个候选瞬时中间状态（CDH1相关聚集阶段）和发散性谱系结局。然而，单供体设计、轨迹精细排序不稳健、参考图谱映射仅部分相似（仅少数细胞可靠类似成熟软骨）以及异源成分实验样本量有限，是主要局限性。这些发现应视为产生假设的，需在独立多供体队列中验证。结论部分翻译如下：总之，这项单供体概念验证研究为USC分化提供了一个产生假设的、单细胞分辨率的框架。它提名了一个候选的瞬时、聚集相关转录状态，并记录了显著的转录异质性，同时表明仅少数分化细胞可靠类似成熟软骨。由于这些观察基于单个供体，且轨迹和映射推断的精细结构不完全稳健，应将其视为有待在独立多供体队列中检验的假设，而非既定结论。更广泛地说，这些结果强调了解析中间和异质性状态、以及从转录程序和细胞状态层面（而非单个标记基因）解读分化系统的重要性。论文发表在《Stem Cell Research》。
