使用化学计量学建模、元启发式波长选择和综合可持续性评估分光光度法测定药物制剂和人血浆中的头孢吡肟（CEF）和恩美唑巴坦（ENM）

《BMC Chemistry》：Spectrophotometric determination of cefepime and enmetazobactam in pharmaceutical formulations and human plasma using chemometric modeling, metaheuristic wavelength selection, and comprehensive sustainability assessment

　　

近期引入的头孢吡肟-恩美唑巴坦（CEF-ENM）联合制剂需要可靠的分析方法用于药物质量控制和概念验证性生物分析评价。现有方法主要为色谱法，依赖于大量有机溶剂、昂贵仪器和高能耗。在本研究中，研究人员建立了一种整合化学计量学分析的紫外分光光度法，用于同时定量药物制剂和经处理的后提取加标人血浆中的CEF和ENM。校准样品根据Brereton多水平实验设计制备，而独立的外部验证集则采用最大最小距离设计（MMD）算法构建。研究人员评估了六种化学计量学模型（经典最小二乘法（CLS）、主成分回归（PCR）、偏最小二乘法（PLS）、遗传算法-偏最小二乘法（GA-PLS）、萤火虫算法-偏最小二乘法（FA-PLS）和多元曲线分辨-交替最小二乘法（MCR-ALS））的分析性能，以解决两种分析物之间的严重光谱重叠问题。研究人员为经处理的血浆样品开发了基质特异性校准模型。所开发的模型表现出优异的分析性能，其中MCR-ALS提供了最高的预测准确度和稳健性。研究人员使用整合的多色评估（MA）工具以及补充的绿色度量指标对可持续性进行了比较评估。与先前报道的色谱方法相比，所提出的方法在保持可靠定量性能的同时，表现出更优的整体可持续性。该方法为常规药物质量控制和经处理的后提取加标人血浆中的概念验证性评价提供了一种快速、经济且环境可持续的替代方案。需要进一步开展全面的生物分析验证以支持常规临床应用。

**论文解读文章**

**1. 研究背景、问题与目的**

近年来，制药科学领域对可持续实践的日益增长的需求已从生产环节延伸至分析流程，分析方法开发需在分析质量与环境责任之间取得平衡。然而，许多传统分析程序仍依赖大量溶剂、昂贵仪器和高能耗操作，导致废物产生和环境影响增加。在抗菌治疗领域，β-内酰胺类抗生素与β-内酰胺酶抑制剂的联合制剂，如新近获批的头孢吡肟（CEF）与恩美唑巴坦（ENM）的组合，是应对多重耐药肠杆菌目细菌等的重要治疗进展。然而，目前针对CEF-ENM联合制剂的分析方法很少，且主要局限于色谱技术（如LC-MS/MS和RP-HPLC），这些方法虽灵敏度高、选择性好，但依赖有机溶剂、昂贵仪器和较长的分析时间，降低了其可持续性，且限制了在资源受限实验室中的常规应用。此外，在可持续分析开发中，单一绿色性指标的孤立改进并不保证整体可持续性提升，有时甚至可能引入隐藏的负担（如操作复杂性增加、资源需求上升等），即“反弹效应”。因此，需要整合的基准化评估策略，以客观评价新方法是否实现了真正的可持续性进步。基于此，本研究旨在开发一种结合紫外分光光度法与化学计量学分析的可持续方法，用于同时定量药物制剂和经处理的后提取加标人血浆中的CEF和ENM，并利用综合性可持续性评估工具对其性能进行全面比较。该论文发表在《BMC Chemistry》。

**2. 主要关键技术方法**

研究人员采用了以下关键技术方法：（1）**紫外分光光度法**（UV spectrophotometry）采集吸收光谱，使用水-乙醇（1:1, v/v）混合溶剂作为工作介质；（2）**Brereton多水平实验设计**构建校准混合物，并结合**最大最小距离设计（MMD）算法**生成独立的外部验证集，以优化校准空间的覆盖和模型评估；（3）开发并比较了六种**化学计量学模型**，包括经典最小二乘法（CLS）、主成分回归（PCR）、偏最小二乘法（PLS）、遗传算法-偏最小二乘法（GA-PLS）、萤火虫算法-偏最小二乘法（FA-PLS）和多元曲线分辨-交替最小二乘法（MCR-ALS），以解决严重的光谱重叠；（4）采用**多色评估（MA）工具**（包含绿色模块GEMAM、蓝色模块BAGI、红色模块RAPI和紫色模块VIGI）进行综合可持续性基准化评估，并与已报道的色谱方法进行比较。血浆样品来源于埃及生物制品与疫苗控股公司（VACSERA）的健康志愿者血浆，经蛋白沉淀处理后进行后提取加标。

**3. 研究结果**

**3.1 工作溶剂选择**
基于可持续性筛选（使用Green Solvent Selection Tool (GSST)和Spider Diagram for Assessment of the Greenness Index (SDAGI)）以及光谱实验评估，水-乙醇（1:1, v/v）混合物被选为工作溶剂，因其在分析性能与环境可持续性之间取得了最佳平衡。

**3.2 化学计量学校准框架开发**
通过分析CEF和ENM的零阶紫外吸收光谱，发现两者在210-250 nm区域存在严重重叠，无法直接进行单变量测定。因此，选择了210-350 nm作为分析波长窗口（141个波长变量），并分别针对药物制剂和血浆基质开发了独立的基质特异性校准模型。Brereton多水平设计生成了25个校准混合物，MMD算法生成了13个外部验证混合物，确保了校准空间和验证空间的均匀覆盖与独立性。

**3.3 化学计量学模型开发与性能比较**
六种模型被应用于两个基质。CLS模型作为基线，表现最差；PCR和PLS通过潜变量投影改善了性能；GA-PLS和FA-PLS通过元启发式波长选择进一步提高了预测精度，其中FA-PLS的降维效果更优（例如，在药物制剂中，FA-PLS保留了71个变量（CEF）和76个变量（ENM），而GA-PLS保留了84和90个变量）。MCR-ALS通过约束双线性分解（非负性、闭合性约束）有效分离了重叠光谱，在所有模型中获得了最高的预测准确度和稳健性，其对于药物制剂的RMSEP_CEF为0.094 μg mL^-1，RMSEP_ENM为0.103 μg mL^-1；对于血浆，RMSEP_CEF为0.121 μg mL^-1，RMSEP_ENM为0.132 μg mL^-1。模型性能排序为：CLS < PCR < PLS < GA-PLS < FA-PLS < MCR-ALS。

**3.4 模型验证与性能**
根据ICH Q2(R1)指南进行验证。所有模型均表现出良好的灵敏度（药物制剂中LOD范围为0.0286-0.0827 μg mL^-1（CEF）和0.0264-0.0743 μg mL^-1（ENM））、准确度（回收率接近100%）、精密度（RSD < 0.87%）和稳健性。统计比较（包括学生t检验、单因素方差分析、椭圆联合置信区间（EJCR）分析、重复交叉验证和Bootstrap重采样）确认了MCR-ALS的优越性，且未发现显著的统计差异或过拟合。

**3.5 药物制剂应用**
该方法成功应用于商业制剂Exblifep^?注射用粉末的定量分析，直接测定和标准加入实验的回收率均在98-102%范围内，RSD < 1.12%，表明其适用于常规质量控制和制剂辅料无干扰。

**3.6 人血浆基质导向评价**
在经处理的后提取加标人血浆中，CEF和ENM的回收率分别为95.62%-98.94%和95.88%-98.97%，精密度RSD < 1.82%。基质因子评估（使用MCR-ALS模型）显示信号抑制在0.9%-2.0%之间，表明蛋白沉淀处理有效，残存基质影响有限。该研究为概念验证性评价，表明血浆特异性校准模型能胜任定量分析。

**3.7 综合可持续性基准化评估**
使用MA工具对四个工作流程（药物制剂分光光度法、血浆分光光度法、已报道的RP-HPLC和LC-MS/MS）进行比较。药物制剂工作流程获得最高整体白度得分（81.1%），血浆工作流程得分74.3%，均优于RP-HPLC（69.9%）和LC-MS/MS（67.2%）。模块分析显示，分光光度法在环境兼容性（GEMAM模块）和操作实用性（BAGI模块）上具有显著优势，且未观察到反弹效应。

**4. 讨论与结论**

讨论部分指出，本研究的局限性在于血浆研究是基于后提取加标样品，而非前提取加标或临床真实标本，因此不构成完整的生物分析方法验证。回收率代表的是加工后血浆基质内的定量回收，而非提取回收。未来需进行全面的生物分析验证（包括多批血浆、临床患者样本、提取回收率、稳定性、稀释完整性等）以支持临床常规应用。此外，该方法旨在作为一种快速、环境可持续的补充平台，而非替代已验证的LC-MS/MS方法。

**研究结论**：该研究成功开发了一种可持续的紫外分光光度-化学计量学方法，用于同时测定药物制剂和经处理的后提取加标人血浆中的CEF和ENM。该方法结合了紫外分光光度法和互补的多变量校准策略，无需色谱分离即可准确量化严重重叠的光谱。基质特异性校准模型在两种基质中均表现出满意的准确性、精密度、预测能力和外部验证性能。在比较的化学计量学模型中，MCR-ALS提供了最佳的整体分析性能。可持续性评估表明，与已报道的色谱方法相比，该方法具有更优的整体可持续性，为常规药物质量控制和概念验证性生物分析提供了一种快速、经济且环境友好的替代方案。但进一步全面的生物分析验证是必要的，以支持常规临床应用。