《Biophysical Reviews》：The rise of state-centric biophysics: integrating orthogonal molecular readouts across biophysical scales
现代生物物理学已从孤立分子性质的测量演变为日益集成的分子表征。仪器、正交工作流和多维分析平台的进步，扩大了从单一实验背景中可获得的分子信息广度，提高了研究人员在此定义为“信息密度”（information density）的指标。在这篇综述中，研究人员审视了支撑这一转变的科学和技术力量，并提出了以状态为中心的生物物理学（state-centric biophysics）作为一种解释框架，其中亲和力（affinity）、动力学（kinetics）、热力学（thermodynamics）、稳定性（stability）、结构动力学（structural dynamics）、流体动力学（hydrodynamics）、配体占用（ligand occupancy）和组装状态（assembly state）等生物物理性质被视为共享分子状态景观（molecular-state landscape）的互补描述符，而非独立的实验输出。代表性案例研究，包括靶向蛋白质降解（targeted protein degradation）、分子胶（molecular glues）、热休克蛋白90（HSP90）分子循环与抑制，以及鼠肉瘤病毒癌基因同源物G12C（KRAS G12C）的状态选择性抑制，说明了生物活性如何经常依赖于超出配体占用之外的分子状态性质。总体而言，这些观察表明，现代生物物理学的核心挑战正日益从测量分子性质转向识别控制机制、效力、选择性和治疗反应的分子状态。
**Introduction**
现代生物物理学在分子识别、蛋白质稳定性、构象行为、结构动力学和生物机制的表征中发挥核心作用。历史上，大多数生物物理技术旨在探测特定分子性质，如亲和力、动力学、热力学、稳定性、结构动力学和分子大小，通常独立测量和解释。当代生物物理学的定义性趋势不是取代这些测量，而是日益集成。现代生物学问题常需要超过单一分子参数，因为分子识别常与稳定性、动力学、组装状态、水合、构象群体或生物功能的变化耦合。因此，分子解释的信心越来越依赖于互补测量是否收敛于同一分子系统的连贯描述。仪器和工作流程设计的进步加速了这一转变，自动化和高通量实验扩大了分子表征的规模，微流控、流动诱导分散分析、集成荧光工作流、电开关生物传感器和质量光度法扩展了通过多个互补维度表征分子系统的能力，同时减少样品消耗。因此，实验越来越多地从同一实验背景生成更广泛的分子信息。在这篇综述中，“信息密度”（information density）指从单一实验、平台、样品或紧密连接的工作流中可获得的分子信息的广度和互补性。其目的是检查分子测量的汇聚作为现代生物物理学的定义性趋势，先描述从单参数表征到正交工作流和集成多维平台的历史进程，再讨论驱动这一演变的科学和技术力量，最后提出以状态为中心的生物物理学（state-centric biophysics）作为解释框架，整合互补分子测量以更好地理解生物机制、药理行为和治疗反应。伴随这一实验演变的重要概念发展是认识到生物分子很少以单一静态结构存在，而是由多个相互转换的构象状态组成的动态热力学集合，其相对群体可通过配体结合、翻译后修饰、环境条件或分子相互作用重新分布。因此，理解生物功能日益需要识别分子识别是否发生，以及哪个分子状态被群体化。
**State-centric biophysics as an interpretive framework**
以状态为中心的生物物理学建立在几个已建立的分子生物物理学领域之上，但并非同义词，因为它们解决相关但不同的科学目标。集合生物物理学（ensemble biophysics）建立蛋白质和分子组装体作为动态相互转换构象群体，而非单一静态结构，聚焦于构象群体和动力学。整合结构生物学（integrative structural biology）结合异质实验信息构建复杂生物系统的结构和机制模型。正交表征工作流（orthogonal characterization workflows）通过多个独立实验测量增加信心。概念上，以状态为中心的生物物理学聚焦于识别实验支持的分子状态，这些状态控制生物和药理行为。这一视角根本基于热力学原理，其中生物功能从相互转换分子状态的群体中涌现，而非单一静态构象。因此，实验测量成为分子扰动如何重新分布这些状态群体并影响生物行为的互补观察。在此框架下，生物物理性质被解释为共同分子状态景观的互补描述符。核心问题从分子是否相互作用、多个测量是否一致或是否能构建结构模型，转向哪个分子状态负责观察到的生物结果，以及实验扰动如何重新分布可达状态之间的群体。以状态为中心的生物物理学不是作为新的实验学科提出，而是作为连接多维分子测量与生物机制、效力、选择性和治疗反应的解释框架。
**Historical evolution of biophysical characterization**
分子生物物理测量的收敛通过一系列技术和方法转变出现，逐渐扩展了生物物理表征的范围。该领域历史不是一系列突然替代，而是连续几代技术增加了新实验能力，同时保留了已有方法的价值。结果是从聚焦于单个分子性质的测量，扩展到日益集成的策略，能够通过多个互补维度描述分子系统。
**Single-parameter molecular characterization**
现代生物物理表征的基础建立于1980年代和1990年代早期，通过设计用于以高物理严谨性探测特定分子性质的技术，如等温滴定量热法（ITC）、差示扫描量热法（DSC）、表面等离子体共振（SPR）、氢-氘交换（HDX）、动态光散射（DLS）和分析超速离心（AUC）。这些技术提供了直接访问分子性质的途径，这些性质通常难以通过其他实验方法获得。ITC允许从溶液相测量直接确定结合常数、化学计量、焓和熵。DSC建立了量化蛋白质和大分子稳定性温度诱导变化的严谨框架。SPR引入实时监测生物分子相互作用，无需标记试剂。氢交换方法提供了连接蛋白质结构与构象动力学和溶剂可及性的途径。尽管这些方法产生高度信息的测量，但每种方法主要强调特定的分子维度：热力学、动力学、稳定性、大小或动力学通常独立测量并在单个实验背景下解释。
**Throughput expansion and automation**
1990年代中期到2000年代早期，生物物理创新的焦点转向实验通量、可重复性和可扩展性。这一转变与制药筛选、组合化学和大规模生物发现项目的日益影响密切相关。光学生物传感器成熟为稳健分析平台，荧光技术如荧光偏振和荧光共振能量转移方法被广泛采用，因为可自动化和小型化。机器人液体处理、微孔板实验和日益复杂的筛选基础设施扩展了给定时间内可进行的实验数量。这一时期转变了分子表征可进行的规模，但单个实验生成的分子信息仍主要分布在不同的分析格式中。主要挑战不再是获得测量，而是协调多个独立实验系统生成的信息。
**Orthogonal characterization workflows**
随着生物系统和药物发现项目变得更复杂，分子解释的信心越来越依赖于多个独立方法之间的一致性。研究者开始结合互补技术，如SPR、ITC、DSC、差示扫描荧光法（DSF）、DLS、尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）、HDX-MS、核磁共振（NMR）光谱、X射线晶体学和小角散射方法。NMR在揭示近生理溶液条件下的构象动力学、瞬态结构状态和群体交换方面发挥了核心作用，建立了现代集合结构生物学的概念基础。HDX-MS通过直接研究溶液中的蛋白质动力学、构象变化和溶剂可及性变得特别重要。这一时期的定义特征不是新技术的出现，而是新实验策略的出现：信心越来越来自独立测量之间的收敛，而非任何单一技术。
**Integrated multidimensional platforms**
从2010年代早期开始，新一代技术出现，日益在相同平台或紧密连接的工作流内结合多种形式的分子表征。流动诱导分散分析（FIDA）展示了在原生溶液条件下通过流体动力学测量使用纳升样品体积量化非共价相互作用。后续发展将分散分析与内在荧光测量结合，在统一工作流中连接分子大小、折叠行为和功能评估。微尺度热泳（MST）在自由溶液中实现相互作用分析，同时对大小、电荷、水合壳和分子环境的变化敏感。电开关DNA芯片技术（switchSENSE）展示了在单一分析框架内同时获取相互作用、动力学、大小和构象信息。质量光度法（mass photometry）实现了溶液中对单个生物分子和复合物的分子质量和群体分布的直接测量，提供与组装状态、相对丰度、相互作用平衡和分子动力学相关的信息。这些发展共同说明了向在共同实验背景下日益集成互补分子维度的平台的更广泛转变。
**Toward integrated characterization**
上述历史轨迹显示从单个分子性质测量到正交工作流和集成平台的进程，这些平台能够在日益统一的实验背景下捕获多个分子维度。这一进程为继续驱动现代生物物理仪器收敛的技术和科学力量奠定了基础。
**Drivers of instrumentation convergence**
历史进程并非源于单一技术突破，而是源于科学和实践压力的组合，这些压力共同重塑了现代生物物理仪器和实验工作流。日益增加的生物复杂性、有限的样品可用性、检测弱和异质分子响应的需求、通量增长的需求，以及跨多个实验平台集成信息的挑战，都鼓励了能够生成更丰富分子表征同时减少实验负担的技术发展。微型化和微流控方法改善了样品经济性，实现了在样品有限条件下的定量表征。检测器灵敏度的进步扩展了对弱、瞬态和异质分子相互作用的访问。自动化和并行化增加了现代药物发现项目的实验通量和可扩展性。溶液状态表征、正交验证策略和可开发性聚焦的工作流拓宽了可同时评估的分子性质范围。计算能力和整合建模方法的增加促进了多维数据集的解释和更全面分子描述的构建。这些发展共同加速了现代生物物理仪器的收敛，为集成和以状态为中心的生物物理表征策略奠定了基础。
**Increasing information density per experiment**
历史演变和上述技术驱动因素朝向共同结果：现代生物物理实验日益从相同样品、实验工作流或分析平台生成更广泛的分子信息。历史上，这些分子维度通常通过单独实验获得并独立解释。正交表征工作流通过整合结合、稳定性、动力学、流体动力学和结构的互补测量扩展了分子洞察。最近，集成平台开始在同一实验背景下生成多个分子读数，增加了从单一样品或工作流中可获得的分子信息广度。尽管这些技术在物理原理上差异很大，但它们共享共同目标：扩展可在共同实验框架内表征的分子维度。这一转变的意义不仅在于生成额外测量，更在于将互补分子维度整合成分子行为的连贯描述。多维表征通过将亲和力、稳定性、结构动力学、流体动力学、聚集和组装状态置于共同实验背景中，加强了生物学解释。这种增加的信息密度为后续章节发展的以状态为中心的框架提供了部分概念基础。
**The emergence of integrated biophysical platforms**
集成生物物理平台在物理原理、实验配置、样品要求和分子敏感性上差异很大，使直接比较不恰当，结果不能互换。每个平台最好根据其直接测量什么、在特定条件下能推断什么以及解释何处变得不确定来理解。保持这一区分至关重要，因为仅当每个测量的物理意义被保留时，集成表征才保持其价值。
**Surface-based interaction platforms**
基于表面的相互作用平台仍是定量结合分析的核心，因其实时报告结合和解离。SPR、阵列SPR、生物层干涉测量（BLI）及相关无标记生物传感器在实验设计和建模适当的情况下，直接提供动力学参数，包括结合速率常数、解离速率常数、停留时间和亲和力。现代高通量生物传感器格式通过启用更大相互作用面板、抗体表征和并行化动力学分析扩展了这一能力。这些平台的主要优势是动力学分辨率。主要限制是分子通常在表面或生物传感器界面被探测，固定化几何、质量传递、再结合、亲和力、基质效应和模型选择可影响解释。复杂传感图可揭示异质性、多相行为或表观构象效应，但基于表面的动力学数据本身不提供残基级结构信息或直接寡聚状态分配。电开关DNA芯片技术（switchSENSE）通过使用电驱动DNA纳米杠杆和荧光检测扩展了基于表面的分析，除相互作用动力学外，还可报告流体动力学直径和构象敏感变化。
**Thermal and stability platforms**
热和稳定性平台通过温度依赖性去折叠、构象转变和聚集相关信号探测分子行为。DSF和nanoDSF广泛用于通过监测热梯度期间的荧光变化跟踪蛋白质稳定性。nanoDSF利用内在色氨酸和酪氨酸荧光报告三级结构变化，无需外源染料，适用于蛋白质稳定性和可比性研究，包括治疗性蛋白质。热分析平台在需要评估构象稳定性、制剂行为或聚集倾向时特别有价值。nanoDSF已应用于抗体热稳定性筛选和缓冲液选择。解释上的注意事项很重要：热位移可能与配体结合、构象稳定性改变或聚集行为变化一致，但不自动等同于亲和力。当实验区分构象去折叠与胶体不稳定，且热位移与浓度依赖性和适当对照一起解释时，热读数最具信息量。
**Solution-state and hydrodynamic platforms**
溶液状态和流体动力学平台提供关于分子大小、扩散、物种分布、复合物形成和聚集的信息，在不需要表面固定化的条件下进行。流动诱导分散分析（FIDA）和泰勒分散分析通过扩散或表观流体动力学半径的变化量化分子相互作用，实现低体积溶液测量非共价相互作用。集成工作流将泰勒分散分析、FIDA和内在荧光连接，在统一蛋白质表征方法中关联分子大小、折叠和功能评估。DLS通过测量扩散依赖的散射涨落提供流体动力学信息，用于评估样品均一性、聚集和表观颗粒大小，但对大颗粒和多分散性高度敏感。SEC-MALS通过色谱分离后进行多角度光散射分析增加了互补维度，在分离和样品质量足够时，可表征单体、寡聚体、聚集体、复合物、糖蛋白和去垢剂相关膜蛋白系统的分子量和大小。流体动力学平台的关键优势是帮助定义实验中存在的物理物种，其局限性是大小、扩散或散射变化本身不识别结合位点或分子机制，当用于确定测量物种是否为单体、寡聚体、聚集、复合物或在实验条件下异质时最强。
**Conformation-sensitive platforms**
构象敏感结合平台检测与相互作用相关的荧光变化、热梯度或局部染料环境变化。微尺度热泳（MST）测量热泳运动的变化，可源于结合相关的尺寸、电荷、水合壳或构象差异。由于实验在自由溶液中进行且可耐受复杂缓冲液，MST对难以固定化或通过基于表面方法分析的系统有用。温度相关强度变化（TRIC）、Dianthus和Spectral Shift实现将荧光基亲和力分析扩展到板兼容或高通量格式。最安全的解释是这些方法量化浓度依赖的结合相关荧光响应。这些方法强大但不应过度解释：荧光位移或热泳响应指示结合相关的信号变化，但不自动指定该变化的结构起源。染料标记、局部环境效应、化合物荧光、聚集、吸附和缓冲液不匹配均可影响响应。因此，构象敏感平台最好描述为亲和力和结合响应方法，对分子环境有条件敏感性，而非独立的结构方法。
**Structural and ensemble platforms**
结构和集合平台添加了仅通过亲和力或稳定性测量无法捕获的分子维度。HDX-MS测量主链酰胺交换作为溶剂可及性和氢键动力学的函数，提供结构动力学、构象保护、配体诱导变化和别构效应的信息。HDX-MS报告集合平均的交换行为，依赖肽段覆盖、反向交换控制、空间分辨率和数据分析选择，解释需要严格实验和报告标准。原生质谱（native MS）充分保留非共价复合物，以分析适合系统的配体结合、化学计量、复合物组成和组装状态，已用于基于片段的药物发现检测弱配体结合和表征化学计量和亲和力。离子迁移质谱（IM-MS）根据离子迁移率和碰撞截面添加气相分离，提供与蛋白质离子和复合物大小和形状相关的信息。这些方法对组成和组装分析强大，但气相转移、电离、加合物形成和原生状态保留需仔细控制和解释。质量光度法提供无标记光学方法，测量溶液中的分子质量分布和单个生物分子及复合物的相对丰度，在适当浓度和质量分辨率条件下可量化蛋白质-蛋白质相互作用和物种分布。整合结构生物学提供概念和计算框架，将异质实验数据结合成连贯结构模型，明确考虑不确定性和分辨率。在生物物理表征背景下，当结构、动态、质量和相互作用数据必须一起解释而非作为单独实验输出时，这些方法最有用。
**Toward state-centric biophysics**
当代生物物理学正从孤立分子性质的测量转向集成、多维的分子系统描述。仪器进步结合日益连接的表征平台和正交工作流，现在使得在统一实验背景下评估亲和力、动力学、热力学、稳定性、结构动力学、流体动力学和组装状态成为可能。在此框架下，分子识别不再被单一参数充分描述；结合必须在被研究系统更广泛的物理状态背景下理解。
**Beyond affinity**
亲和力仍是分子识别最重要的描述符之一，平衡解离常数量化结合和未结合状态之间的自由能差，对机制研究和药物发现都至关重要。然而，仅凭亲和力很少提供分子行为的完整描述。两个具有相同平衡亲和力的相互作用可能表现出显著不同的结合速率、解离速率、停留时间、热力学特征、构象后果或生物结果。亲和力也不直接报告结合是否与构象变化、稳定性改变、寡聚化、聚集、构象群体重新分布或组装状态变化耦合。因此，结合常数代表分子识别的重要描述，但不一定识别该识别发生的分子状态或定义被探测的分子系统的物理条件。
**Molecular recognition as population redistribution**
现代生物分子行为观点认识到蛋白质和分子组装体作为动态集合而非单一静态结构存在。在此条件下，分子识别常与状态群体变化相关。结合可能稳定预先存在的构象、改变平衡分布、改变结构动力学、促进组装形成或调节别构通信途径。因此，相互作用的生物学重要性不仅取决于结合是否发生，还取决于该相互作用如何重新分布可达分子状态之间的群体。这一观点有助于解释为什么具有相似表观亲和力的相互作用可产生显著不同的生物结果。分子识别可能发生在折叠单体、瞬态中间体、寡聚体组装体、异质群体或动态涨落构象集合中，每个都与不同的功能后果相关。亲和力、动力学、稳定性、动力学和组装状态因此成为同一分子系统的相互关联表现，而非分子行为的独立描述符。
**State-centric interpretation**
以状态为中心的生物物理学提供了一个解释框架，将互补分子测量整合成实验支持的分子行为描述。它不孤立评估单个生物物理参数，而是寻求确定哪个分子状态控制生物功能，以及实验扰动如何重新分布可达状态之间的群体。现代生物物理方法为这一目标贡献互补信息：结构动力学方法如HDX-MS揭示构象保护、灵活性和别构扰动；流体动力学测量识别分子大小和复合物形成的变化；原生质谱、SEC-MALS和质量光度法表征化学计量、组装状态和群体分布；稳定性测量揭示构象稳健性和聚集倾向的变化。以状态为中心的生物物理学不取代传统生物物理测量，而是提供集体解释它们的框架。随着多维表征日益可及，解释焦点从判断结合是否发生转向确定哪个分子状态被测量以及实验扰动如何重新分布可达状态之间的群体。
**Impact on drug discovery and biological research**
多维和以状态为中心的生物物理学的出现对仪器、实验设计和数据集成之外有影响。这些方法的价值最终在于其改善复杂分子系统解释的能力。当生物靶点显示弱结合、构象异质性、动态组装行为或机制复杂性，无法通过孤立测量充分描述时，这一影响变得特别明显。在这些背景下，将分子识别置于更广泛的状态依赖框架中的能力可以显著影响实验解释和决策。
**Complex targets, molecular assemblies, and state-dependent recognition**
现代生物学和药物发现中最具挑战性的系统不表现为简单刚性分子实体。内在无序蛋白、多结构域信号蛋白、膜蛋白、诱导邻近系统、分子胶、瞬态复合物和高阶分子组装体作为动态群体而非单一明确定义结构存在。在此条件下，分子识别常与构象、寡聚化、组装状态、动力学或群体分布的变化耦合。因此，相互作用的生物学重要性可能同样取决于系统的分子状态和相互作用本身。这种复杂性在弱和瞬态相互作用中尤为明显，区分生产性分子识别与非特异性结合、聚集、亲和力效应或实验依赖的伪影可能具有挑战性。构象异质性可产生配体具有相似表观亲和力但稳定不同构象群体并因此产生不同生物结果的情况。分子组装体引入额外复杂性，因为化学计量、组装状态、亚基交换和群体分布可独立于亲和力测量影响生物行为。从实践角度看，多维生物物理学的价值不是消除不确定性，而是帮助识别不确定性的分子起源。互补测量可揭示分子响应是否与构象稳定化、动力学改变、组装状态重新分布、寡聚化、聚集或其他状态依赖现象相关。信心因此来自测量生成的分子描述的连贯性，而非收集的测量数量。
**Real-world examples of state-centric interpretation**
当集成测量揭示无法从亲和力单独推断的机制特征时，以状态为中心的生物物理学的实用价值变得最为明显。类似的相互作用测量在通过互补实验维度考察时可能对应根本不同的分子状态和生物结果。第一个例子是蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）。经典的二元亲和力测量量化PROTAC与其单个蛋白伙伴的相互作用，但后续结构、动力学和降解研究表明生物活性强烈依赖于靶蛋白、PROTAC和招募的E3连接酶之间形成的三元复合物的性质。在溴结构域和额外末端结构域（BET）降解剂MZ1案例中，结构研究揭示了高度协同的三元复合物形成，尽管二元亲和力适中。SPR测量进一步表明三元复合物解离动力学与降解效率的相关性比二元亲和力更强。因此，相似亲和力测量可导致显著不同的生物结果，因为相关分子状态由三元复合物稳定性、协同性和停留时间而非二元结合强度定义。第二个例子来自分子胶降解剂。传统基于亲和力的解释会预测活性主要来自单个分子伙伴之间的直接结合，但结合原生质谱和质量光度法的研究表明分子胶可在E3连接酶系统内重塑寡聚体平衡并改变组装状态群体。在这些案例中，生物机制未通过单一结合相互作用充分描述；相反，化合物促进了替代组装状态之间的重新分布，产生了依赖于复合物组成和群体丰度的功能结果。相关分子状态因此涉及组装架构和寡聚体组织而非仅亲和力。第三个例子是热休克蛋白90（HSP90）抑制剂表征。许多HSP90配体尽管产生不同生物效应，但表现出相当的结合亲和力。结合动力学测量、结构分析、分子模拟和机器学习方法的整合研究表明，具有相似平衡亲和力的配体可稳定不同构象集合并参与不同别构通信途径。在纯亲和力中心解释下，这些配体看起来
