《The Cerebellum》：Generation and Validation of an Acan-Cre Mouse Line to Selectively Label Class-B Excitatory Neurons of the Cerebellar Nuclei
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小脑核（cerebellar nuclei）构成小脑的主要输出结构，由一组深度保守的细胞类型组成。在每个小脑核中均存在两类兴奋性神经元，即Class-A和Class-B，它们介导小脑的所有兴奋性输出。为提供针对这些细胞类型的遗传学获取手段，研究人员将Acan鉴
小脑核（cerebellar nuclei）构成小脑的主要输出结构，由一组深度保守的细胞类型组成。在每个小脑核中均存在两类兴奋性神经元，即Class-A和Class-B，它们介导小脑的所有兴奋性输出。为提供针对这些细胞类型的遗传学获取手段，研究人员将Acan鉴定为Class-B细胞的标志基因，并构建了敲入型Acan-P2A-Cre小鼠品系。研究人员证明，该Acan-Cre品系能够选择性标记小脑核中的Class-B神经元，并验证了其在病毒投射示踪中的应用。该新型小鼠品系为研究小脑核的组织结构和功能提供了宝贵的遗传学工具。
Acan-Cre小鼠品系：选择性标记小脑核B类兴奋性神经元的新型遗传工具
**研究背景与意义**
小脑核（cerebellar nuclei）构成小脑的主要输出结构，在运动与认知功能中发挥核心作用。近年来的单细胞研究揭示，每个小脑核均由一套重复的细胞类型组合构成，包括两类分子定义的兴奋性投射神经元（Class-A和Class-B）以及三类抑制性神经元。Class-A与Class-B细胞负责小脑全部兴奋性输出，并在3亿年的羊膜动物进化中高度保守。这两类神经元处于关键的环路位置，整合小脑计算并将信息传递至全脑。既往研究表明，两类兴奋性神经元在投射模式、形态学和电生理特性上均存在显著差异，推测它们作为根本不同的输出通道，差异性地参与小脑功能与疾病。特别是Class-B细胞对应小脑核中的大兴奋性神经元及既往报道的小鼠GadNL细胞，并在人类外侧核中以牺牲Class-A细胞为代价而特异性扩增。此外，大谷氨酸能Class-B神经元可能在Friedreich共济失调等神经退行性疾病中选择性易损。然而，尽管这些细胞具有重要功能意义，此前尚无遗传工具能够选择性获取这些细胞类型，严重阻碍了对其功能的解析。本研究旨在开发并验证一种能够选择性标记小脑核Class-B神经元的新型Cre驱动小鼠品系，论文发表于《The Cerebellum》。
**技术方法**
研究人员利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术，将P2A-Cre序列插入Acan基因内源终止密码子上游，构建了Acan-P2A-Cre敲入小鼠品系（C57Bl6/J背景），并经长读长测序验证整合准确性。通过立体定位注射Cre依赖性AAV2-CAG-FLEx-eGFP，结合BARseq3原位测序技术（靶向11个标志基因）鉴定被标记细胞的分子身份，并利用顺行示踪比较Class-B与全部兴奋性神经元的全脑投射模式。样本包括：原位转录组学实验使用2只Acan-Cre和1只野生型小鼠；顺行示踪实验使用5只Slc17a6-Cre和7只Acan-Cre小鼠。
**研究结果**
**Acan-P2A-Cre敲入小鼠品系的生成**
研究人员查询已发表的单核RNA测序数据及Allen Brain Cell图谱，发现Acan在全部小脑核的Class-B细胞中中等水平表达，在Class-A、抑制性神经元中无表达，在非神经细胞中表达极低，因此选定Acan作为Class-B细胞的标志基因。通过CRISPR/Cas9将P2A-Cre序列精准插入Acan-201转录本终止密码子上游，长读长测序确认了等位基因的完整性和插入的精确性。半合子Acan-P2A-Cre动物表现健康，其小脑核中Acan表达水平与野生型无统计学差异；而纯合子小鼠出现矮小表型，提示该等位基因具有轻度亚效性，因此研究全程使用半合子小鼠。
**Acan-Cre选择性标记成年小脑核Class-B兴奋性神经元**
研究人员将Cre依赖性AAV注射至Acan-Cre和野生型小鼠的小脑核，仅在Acan-Cre动物中观察到三个小脑核大神经元的强标记。通过BARseq3空间转录组学分析，研究人员在不同Gfp表达阈值下评估病毒标记的细胞类型特异性。结果显示，Gfp信号在所有阈值下均强烈富集于Class-B神经元，而Class-A、抑制性及非神经细胞群体中标记极少。该结果证明Acan-Cre品系能够为成年小脑核Class-B群体提供选择性遗传获取途径。
**Class-B兴奋性神经元呈现独特投射模式**
为对比外侧核Class-A与Class-B神经元的全脑投射差异，研究人员分别向Acan-Cre（标记Class-B）和Slc17a6-Cre（标记全部兴奋性神经元）小鼠的外侧核注射Cre依赖性AAV。结果显示，Acan-Cre的投射区域为Slc17a6-Cre投射的严格子集。上丘（SC）和前顶盖核（APT）在Slc17a6-Cre小鼠中被显著支配，但在Acan-Cre小鼠中极少或没有神经支配；后丘脑核（PO）和外侧后丘脑区（LPMR）同样仅被Slc17a6-Cre神经元靶向。相比之下，VM、VL、PC和CM等丘脑核团在两种品系中均被类似靶向，而ZI在Slc17a6-Cre中更为显著。值得注意的是，在VP、VL和VM等两种品系共同标记的区域中，Acan-Cre投射形成嵌入于Slc17a6-Cre更广阔投射场内的空间受限亚域，提示这些靶区域内存在功能区隔。
**总结与讨论**
本研究首次报道并验证了Acan-P2A-Cre小鼠品系，其为选择性获取小脑核Class-B兴奋性神经元提供了关键的遗传工具，克服了既往Acan-creERT2品系（Jax #019148）无法标记小脑核细胞的缺陷。研究结果独立且趋同地支持了小脑核内存在不同兴奋性输出环路的观点。研究人员预期，通过Slc17a6-FlpO（Jax #030212）与Acan-Cre的杂交，结合FlpON；CreOFF策略，可实现Class-A细胞的遗传获取。此类策略有望最终实现动物个体内对两条主要兴奋性输出通道的比较，并推动对它们各自在全脑网络功能中贡献的因果性解析。
