CRISPR/Cas9介导的杂合HNF1A突变在患者来源hiPSCs中的修复

《Human Genetics》：CRISPR/Cas9-based repair of a heterozygous HNF1A mutation in patient-derived hiPSCs

　　

人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）是疾病建模的有力平台，尤其在单基因病中，可在保留供体遗传背景的同时定向分化为疾病相关细胞类型。尽管CRISPR/Cas9广泛用于基因组编辑，但hiPSCs中致病变异的精确修复仍具挑战，缺乏标准化的CRISPR组件选择与实验设计。研究人员描述了一种优化的基于CRISPR的策略，用于纠正HNF1A-MODY患者来源hiPSCs中的杂合HNF1A移码突变（c.235_236insG；p.Glu79Glyfs*16）。通过电穿孔高效递送CRISPR组件，包括Cas9与单链向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）形成的核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）复合物，以及单链寡脱氧核苷酸（single-stranded oligodeoxynucleotide，ssODN）修复模板。校正后的hiPSC系经多能性、外源重编程因子缺失及脱靶效应验证。研究人员讨论了编辑过程中的关键技术挑战，并给出可提高突变校正hiPSC系生成效率的实用建议。这些指南可为采用CRISPR策略生成可靠疾病建模工具的研究人员提供参考。

研究背景与立项依据

成熟型糖尿病（Maturity-onset diabetes of the young，MODY）是一种遗传性单基因糖尿病，其中HNF1A-MODY最为常见，由HNF1A基因突变（多为杂合）引起，影响胰岛β细胞发育、胰岛素分泌与葡萄糖稳态。人诱导多能干细胞（hiPSCs）能保留供体遗传背景并分化为疾病相关细胞，是单基因病机制研究的理想平台。构建等基因系（isogenic lines）可排除个体间遗传背景干扰，而CRISPR/Cas9介导的同源定向修复（homology-directed repair，HDR）是实现精确校正的主流路径，但在hiPSCs中HDR效率仅约1–10%，且与非同源末端连接（non-homologous end joining，NHEJ）竞争，叠加脱靶、克隆变异与编辑效率限制，使得患者来源hiPSCs的精确修复困难。该研究以一例携带HNF1A杂合移码突变c.235_236insG（p.Glu79Glyfs*16）的HNF1A-MODY男性患者（27岁采血）来源hiPSCs为对象，旨在建立优化的CRISPR/RNP-ssODN校正流程并总结技术要点，论文发表于《Human Genetics》。

主要关键技术方法

研究人员从患者外周血单核细胞（PBMCs）经Sendai非整合病毒重编程获hiPSCs；采用CRISPOR、CHOPCHOP、Cas-Designer三工具交叉预测sgRNA，先在HepG2中预筛编辑效率再用于hiPSCs；以PX459质粒转染初筛、最终采用Cas9-GFP/sgRNA RNP复合体联合150 nt不对称同源臂ssODN（含PAM沉默突变G234T）经Lonza Nucleofector IIb及MaxCyte ExPERT GTx电穿孔；以Surveyor核酸酶初筛、Sanger测序确认，并用TIDE/DECODR分解indel；克隆经免疫荧光（NANOG、OCT-3/4等）、胚状体三胚层分化、qPCR/Western blot检测HNF1A表达、脱靶位点（GSE1）Sanger验证及核型/支原体检测。

研究结果

Patient information：患者为杂合c.235_236insG突变，18岁确诊HNF1A-MODY，无血管并发症，来源hiPSCs用于构建等基因对照。

gRNA design：80 nt靶序列经三工具预测，突变引入新等位特异性位点（gRNA-2），选定gRNA-1/2/3；CRISPOR显示预测脱靶均在seed区外≥3错配。

Engineering of plasmid gRNA-containing vectors, hiPSCs electroporation, and identification of the most promising gRNA：PX459-gRNA质粒转染hiPSCs因单等位移码干扰TIDE/DECODR判读；改以HepG2（无HNF1A突变、转染效率高）预筛，gRNA-1编辑效率最高（TIDE 27.2%，DECODR 21.9%，3 nt缺失+1 nt插入），选其用于RNP校正。

ssODN HDR template design：150 nt ssODN，PAM远端臂93 nt/近端臂54 nt不对称，Alt-R化学修饰，引入沉默突变c.G234T（GGG→GGT）防再切割。

CRISPR-Cas9 repair of HNF1A-mutated hiPSCs：Lonza电穿+GFP⁺单细胞分选288个零存活；免分选约50克隆无校正。换MaxCyte系统，sgRNA:Cas9-GFP=2:1摩尔比，ssODN 2.5–10.0 μM，±SCR7（DNA ligase IV抑制剂），12条件共观察258克隆，113克隆扩培，Surveyor初筛14个测序，获5个HDR校正但4个带额外突变或失传，仅condition 5存1克隆；冻存condition 11细胞复苏后得60克隆，18个测序获3个校正、1个精确无额外indel。总计173克隆初筛32个测序，8个HDR校正，仅2个精确无功能影响（Repaired Clone 1/2），整体精确校正率约1%。校正克隆携杂合沉默突变c.G234T。

Off-target analysis：预测22个CRISPOR脱靶（21个4错配，1个GSE1内含子3错配），Sanger验证GSE1无修饰。

Pluripotency characterization of the repaired hiPSC clones：免疫荧光NANOG/OCT-3/4/TRA-1-60/TRA-1-81阳性；胚状体分化为GATA4⁺内胚层、Vimentin⁺中胚层、Tubulin-β3⁺外胚层；核型正常、无重编程载体、无支原体/HIV。

Effect of the mutation repair on HNF1A expression levels：qPCR与Western blot显示校正克隆HNF1A mRNA/蛋白水平与突变系无差异（野生等位补偿）；但既往研究显示校正后hiPSC衍生内皮细胞糖萼层恢复，转录组见ECM下调、免疫/细胞周期/糖代谢上调，与另一等基因集一致。

讨论与结论翻译

研究人员指出，hiPSCs中HDR受限源于S/G2期依赖、NHEJ竞争、p53应激、染色质可及性低；Cas9-GFP分选在该系中因机械与电穿双重应激致存活极低且不提升HDR，文献亦报Cas9-GFP可令敲除效率降倍，故不建议常规用于hiPSCs除非系耐受性强；SCR7虽增菌落数但未显著提升HDR，且其对LIG4选择性受质疑，需联用RS-1或DNA-PKcs抑制等。电穿平台间差异大，MaxCyte在存活与敲入优于Lonza IIb，需预试GFP参数。该研究成功以RNP-ssODN在患者hiPSCs校正杂合c.235_236insG，获2株精确克隆，证明HepG2预筛sgRNA、不对称ssODN、沉默PAM突变、MaxCyte中高能程序、免分选大池克隆+Surveyor初筛+冻存复苏扩容、是可行优化路径；校正虽不改变未分化态HNF1A表达，但恢复内皮糖萼与转录网络，为HNF1A-MODY等基因建模提供可复用技术参照。结论可译为：尽管HDR基础效率低下，通过电穿平台切换、RNP递送、ssODN结构优化与克隆筛选流程重构，仍可从患者来源hiPSCs中获得精确校正克隆，且校正系多能性与基因组完整性得以保持，该流程与注意事项可服务于单基因病CRISPR校正建模的标准化。