《Frontiers in Immunology》：Knockout of p47phox inhibits deep vein thrombosis by regulating the PAC-1/FNG/MAC-1 signaling axis and ameliorating mitochondrial dysfunction
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目的：通过研究NADPH氧化酶关键亚基p47phox对中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）生成、PAC-1/FNG/MAC-1信号轴及内皮线粒体功能的调控作用，阐明p47phox在深静脉血栓形成（DVT）中的作用及分子机制，从而为靶向治疗策略提供理论基础。方法：采
目的：通过研究NADPH氧化酶关键亚基p47phox对中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）生成、PAC-1/FNG/MAC-1信号轴及内皮线粒体功能的调控作用，阐明p47phox在深静脉血栓形成（DVT）中的作用及分子机制，从而为靶向治疗策略提供理论基础。方法：采集健康志愿者和DVT患者外周血，评估p47phox表达、NETs相关标志物及凝血参数。利用p47phox基因敲除（p47phox-/-）小鼠和野生型（WT）C57BL/6NJ小鼠建立DVT模型，比较血栓发生率、重量和长度。分离血小板、中性粒细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECs），并对p47phox表达进行实验性操作。采用流式细胞术评估整合素αIIbβ3活化（PAC-1结合）、MAC-1活化水平及ROS生成。Western blot分析相关信号蛋白和线粒体功能蛋白的表达。免疫荧光检测NETs标志物及PAC-1、FNG、MAC-1的共定位。进行NETosis、凝血功能（凝血酶原时间[PT]、活化部分凝血活酶时间[APTT]、组织因子途径抑制剂[TFPI]等）及三磷酸腺苷（ATP）生成测定作为补充验证。结果：与WT小鼠相比，p47phox-/-小鼠血栓发生率、重量和长度均降低。DVT患者中性粒细胞中p47phox mRNA和蛋白表达升高。p47phox-/-小鼠血栓中组蛋白H3阳性信号减少，血浆游离DNA（cfDNA）、髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）水平降低；佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）刺激后的NETs释放亦减弱。p47phox-/-小鼠血小板表现出PAC-1结合和纤维蛋白原（FNG）结合能力降低，血栓中PAC-1-FNG-MAC-1共定位面积及相关信号蛋白表达减少。HUVECs中敲低p47phox导致ROS生成减少，同时线粒体数量、膜电位和ATP产生增加。结论：系统性p47phox缺失通过抑制PAC-1/FNG/MAC-1信号轴影响血小板-中性粒细胞相互作用和NETs生成，并通过改善ROS介导的线粒体功能障碍保护内皮细胞，从而抑制DVT形成。尽管体外实验提示这些多细胞机制的参与，但各细胞类型的具体贡献仍需进一步验证。
静脉血栓栓塞症（VTE）位居心血管致死原因第三位，深静脉血栓形成（DVT）是其最常见形式，可继发致命的肺栓塞（PE）。约半数DVT患者可能发生血栓后综合征，约三分之一患者10年内复发。尽管现有治疗包括溶栓药物、抗凝剂、下腔静脉滤器置入及血栓切除术，但仍缺乏统一高效的治疗策略。DVT的病理机制涉及静脉淤滞、内皮损伤和高凝状态，其中中性粒细胞-血小板相互作用是血栓形成的核心事件。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）通过释放DNA纤维、组蛋白和蛋白酶促进凝血级联及血小板活化，具体机制包括：NETs的染色质纤维网架通过负电荷表面捕获红细胞、浓缩凝血因子形成促凝血支架；DNA可经晚期糖基化终末产物受体（RAGE）激活因子XII和血小板；组蛋白H3/H4结合血小板Toll样受体2（TLR2）或TLR4促使其释放颗粒内容物；中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）降解组织因子途径抑制剂（TFPI）抑制血栓溶解。NADPH氧化酶（NOX2）复合物关键胞质亚基p47phox是中性粒细胞活性氧（ROS）的主要来源，但其在DVT中调控PAC-1/FNG/MAC-1信号轴及NETs生成的具体机制尚不清楚。本研究旨在阐明p47phox在DVT形成中的作用及分子机制，为靶向治疗提供理论依据。
研究人员采用p47phox基因敲除（p47phox-/-）小鼠及野生型（WT）C57BL/6NJ小鼠建立下腔静脉结扎DVT模型，以左肾静脉为标志分离并结扎下腔静脉，术后24小时取材；同时采集健康志愿者和DVT患者外周血。分离小鼠及人血小板、骨髓或外周血中性粒细胞和人脐静脉内皮细胞（HUVECs），通过小干扰RNA（siRNA）和过表达质粒实验性调控p47phox表达。运用流式细胞术检测整合素αIIbβ3活化（PAC-1结合）、MAC-1活化及ROS生成；Western blot分析信号通路及线粒体功能蛋白；免疫荧光检测NETs标志物及PAC-1/FNG/MAC-1共定位；辅以NETosis测定、凝血功能检测（PT、APTT、TFPI）和ATP生成测定。研究人员发现：第一，p47phox
