核心氧化磷酸化相关基因作为烧伤免疫反应和诊断生物标志物的鉴定与验证

《Frontiers in Immunology》：Identification and validation of core oxidative phosphorylation-related genes as biomarkers for immune response and diagnosis in burn injury

　　

摘要
引言：烧伤是一种常见且破坏性的创伤，会深刻改变免疫微环境，进而影响患者恢复和临床结局。本研究旨在描绘烧伤患者的免疫图谱，并识别用于早期诊断和靶向治疗策略的关键生物标志物。
方法：利用GSE37069和GSE19743数据集中的转录组数据进行差异表达分析，筛选氧化磷酸化相关基因（oxidative phosphorylation-related genes）。结合三种机器学习算法（SVM-RFE、随机森林和Lasso）筛选核心基因。通过定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）在烧伤组织中验证候选基因的差异表达。使用CIBERSORT算法分析免疫细胞浸润谱。分析核心基因与免疫细胞亚群之间的相关性。在脂多糖（LPS）刺激的THP-1来源巨噬细胞中进行基因沉默实验，以探索功能机制，并构建诊断列线图（nomogram）以评估诊断性能。
结果：共鉴定出23个氧化磷酸化相关差异表达基因。筛选出三个核心基因——ATP6V1C1、ECHS1和LDHA，并证实它们与烧伤进展显著相关。免疫浸润分析揭示了两组患者之间不同的免疫细胞组成：A组患者表现出更活跃的免疫反应，B细胞、M0巨噬细胞和CD4⁺记忆T细胞水平升高，而B组患者CD8⁺T细胞和静息NK细胞比例更高，表明免疫耐受状态。相关性分析提示ECHS1可能参与调节免疫细胞活性，而ATP6V1C1和LDHA可能参与早期免疫反应。体外验证显示，敲低ATP6V1C1或LDHA显著减弱了促炎细胞因子（IL-6、TNF-α、IFN-γ）的分泌，以及线粒体活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成和耗氧量；相比之下，ECHS1敲低进一步放大了炎症反应。基于三个核心基因的诊断列线图表现出优异的诊断性能。
讨论：这些发现为烧伤患者的免疫动力学提供了有价值的见解。所鉴定的核心基因突出了改善预后和治疗结局的潜在分子靶点，而列线图则为烧伤患者分层和个体化治疗提供了有前景的工具。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

烧伤是全球最常见且破坏性最强的创伤之一，其特征为严重组织损伤、显著的系统性炎症反应以及高发病率与死亡率。烧伤后机体经历复杂的病理生理变化，核心包括局部组织破坏、全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS）和多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS）。尽管液体复苏、抗感染治疗和创面管理等综合治疗措施不断改进，早期诊断和烧伤严重程度准确评估仍是临床管理的主要挑战。由于缺乏敏感且特异的生物标志物，临床判断主要依赖经验与传统评分系统，不足以实现个体化治疗。因此，识别能够早期检测烧伤状态并反映病理变化的分子生物标志物，对于指导精准治疗和改善患者预后具有重要意义。

烧伤后免疫反应呈双相特征：早期过度炎症反应，后期免疫抑制，进一步增加感染和器官衰竭风险。氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）是线粒体细胞能量产生的主要途径，越来越多证据表明其是免疫细胞激活、分化和效应功能的关键决定因素。烧伤后，机体应激和炎症信号级联反应（如NF-κB、MAPK、JAK/STAT通路）与线粒体能量代谢紧密耦合；过度炎症和内皮损伤伴随线粒体稳态失衡和氧化磷酸化活性紊乱，促进氧化应激、代谢失调和多器官损伤。因此，系统分析烧伤中氧化磷酸化相关调控网络，有助于深入理解其分子病理机制，并为早期诊断生物标志物和潜在治疗靶点提供新思路。

**研究内容与结论**

研究人员基于此背景，旨在全面分析转录组数据与氧化磷酸化相关基因，识别与烧伤密切相关的关键OXPHOS相关基因，探讨其生物学功能和潜在信号通路，并构建基于OXPHOS相关基因特征的烧伤诊断模型。通过机器学习算法验证和评估模型性能，为烧伤早期诊断提供新的分子证据，并为精准治疗和疾病风险分层提供见解。该论文发表在《Frontiers in Immunology》。

**主要关键技术方法**

研究人员从GEO数据库下载GSE37069（553个烧伤样本和37个对照样本）和GSE19743（114个烧伤样本和63个对照样本）数据集，分别作为训练集和独立外部验证集。从MSigDB获取氧化磷酸化基因集（HALLMARK_OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION.v2025.1.Hs）。采用limma包进行差异表达分析，结合三种机器学习算法（SVM-RFE、随机森林和Lasso）筛选核心基因。通过qPCR和Western blot在20对烧伤组织和相邻正常组织（来自中山大学附属第五医院，经伦理批准）中验证核心基因表达。使用CIBERSORT算法评估免疫细胞浸润，并进行Spearman相关性分析。在PMA分化的THP-1来源巨噬细胞中，通过siRNA沉默核心基因，利用ELISA检测细胞因子，Seahorse XF分析仪测量线粒体耗氧率（oxygen consumption rate, OCR），流式细胞术检测ROS。

**研究结果**

**3.1 烧伤患者转录组中氧化磷酸化相关基因的筛选**
在GSE37069数据集中，以|log2FC|>1且P<0.05为阈值，鉴定出2741个差异表达基因（2170个下调，571个上调）。与MSigDB的200个氧化磷酸化相关基因取交集，获得23个候选基因。GO和KEGG富集分析显示，这些基因主要富集于线粒体相关组分（如线粒体蛋白复合物、线粒体核仁）、生物学过程（如线粒体组织、线粒体膜组织）和分子功能（如氧化还原酶活性、电子传递活性），以及氧化磷酸化、丙酸代谢和脂肪酸降解等通路。

**3.2 核心基因的验证与功能分析**
通过SVM-RFE、随机森林和Lasso三种算法筛选，三个核心基因ATP6V1C1、ECHS1和LDHA被共同选出。在训练集（GSE37069）和测试集（GSE19743）中，ATP6V1C1和LDHA在烧伤样本中显著上调，ECHS1显著下调。ROC曲线显示，三个基因在训练集的AUC分别为0.978、0.953和0.975，在测试集为0.958、0.856和0.929。相关性分析表明，ECHS1与ATP6V1C1和LDHA呈负相关，而ATP6V1C1与LDHA呈正相关。

**3.3 列线图的构建与验证**
基于三个核心基因构建logistic回归诊断模型，列线图可视化。决策曲线分析（DCA）显示模型临床净收益高于单一基因；校准曲线表明预测概率与实际概率一致性良好。训练集AUC为0.989，验证集AUC为0.952。多变量logistic回归显示LDHA为独立预测因子（OR=30.92，95% CI 3.12–305.97，P=0.003），而ATP6V1C1和ECHS1因强相关性在模型中仍具协同作用。

**3.4 烧伤患者的一致性聚类**
基于三个核心基因表达进行一致性聚类（k=2），将烧伤患者分为A组和B组。A组中ECHS1表达显著低于B组，而ATP6V1C1和LDHA表达显著高于B组。

**3.5 亚组功能聚类与免疫浸润分析**
A组与B组间差异表达分析鉴定出227个差异基因，KEGG富集于炎症性肠病、造血细胞谱系、Th17细胞分化等通路；GO富集于白细胞介导免疫、免疫受体活性等。GSEA显示A组激活抗原加工与呈递、自身免疫性甲状腺疾病等通路，B组激活淀粉和蔗糖代谢、糖鞘脂生物合成等通路。CIBERSORT免疫浸润分析表明，A组具有更高比例的初始B细胞、M0巨噬细胞和活化CD4⁺记忆T细胞，而CD8⁺T细胞、静息CD4⁺记忆T细胞和静息NK细胞比例较低。

**3.6 核心基因与免疫细胞浸润的相关性分析**
烧伤后，单核细胞、M0巨噬细胞和中性粒细胞显著增加，初始B细胞、初始CD4⁺T细胞和活化CD4⁺记忆T细胞显著减少。ECHS1表达与B细胞、初始CD4⁺T细胞和静息NK细胞呈正相关；ATP6V1C1和LDHA表达与单核细胞、M0巨噬细胞和中性粒细胞呈正相关。

**3.7 临床烧伤样本中核心基因表达的实验验证**
qPCR和Western blot在20对烧伤及相邻正常组织中验证，ATP6V1C1和LDHA的mRNA和蛋白水平在烧伤组显著升高，ECHS1显著降低，与生物信息学预测一致。

**3.8 沉默氧化磷酸化相关基因重塑巨噬细胞炎症因子产生**
在LPS刺激的THP-1巨噬细胞中，ATP6V1C1和LDHA mRNA上调，ECHS1下调。沉默ATP6V1C1或LDHA显著降低LPS诱导的IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA及蛋白水平，而沉默ECHS1则进一步升高这些促炎因子并降低IL-10。

**3.9 沉默氧化磷酸化相关基因改变线粒体氧化代谢**
LPS刺激显著增加线粒体耗氧率（OCR），包括最大呼吸、ATP产生和备用呼吸能力。沉默ATP6V1C1强烈抑制LPS诱导的线粒体呼吸增加，沉默LDHA部分减少，而沉默ECHS1进一步增强OCR。同时，LPS刺激增加细胞内ROS，沉默ATP6V1C1显著减少ROS积累。

**讨论与结论**

讨论部分指出，氧化磷酸化是细胞能量代谢的核心过程，不仅直接调节能量供应，还在细胞应激反应、代谢平衡和细胞存活中起关键作用。烧伤后代谢失调加剧线粒体功能障碍，导致免疫反应异常和修复延迟。本研究通过差异表达分析鉴定出与烧伤显著相关的关键基因，富集分析表明这些基因主要参与线粒体功能调节。三个核心基因ATP6V1C1、ECHS1和LDHA在能量代谢和免疫调节中发挥重要作用。免疫浸润分析显示A组免疫反应更活跃，B组呈免疫耐受状态。ECHS1与免疫细胞亚群正相关，可能增强B细胞、初始CD4⁺T细胞和静息NK细胞活性；ATP6V1C1和LDHA与单核细胞、M0巨噬细胞和中性粒细胞正相关，参与早期免疫反应。体外功能实验证实，这些基因直接调控巨噬细胞炎症因子产生和线粒体代谢，支持其免疫代谢角色。

研究结论部分翻译如下：
总之，烧伤患者免疫微环境的改变与免疫细胞活性和功能密切相关，这一过程受氧化磷酸化基因调控。这凸显了免疫细胞与核心基因之间的复杂相互作用。这些发现为烧伤免疫治疗提供了新视角和潜在靶点。本研究通过详细分析氧化磷酸化基因及其在烧伤后免疫微环境中的作用，阐明了它们可能在烧伤后代谢调节和免疫反应中的参与。未来研究可聚焦于这些关键基因，探索其调控机制，为烧伤个体化治疗提供理论支持。通过精准干预这些基因及其信号通路，可能出现改善免疫反应和组织修复的新治疗策略，从而提升烧伤患者的诊断和预后。