养殖红藻Porphyra dioica不同生命阶段相关的可培养酵母

《Frontiers in Microbiology》：Culturable yeasts associated to different life stages of the farmed red seaweed Porphyra dioica

　　

与大藻相关的微生物组日益被认为是宿主适应性、生物地球化学循环以及工业水产养殖中培养稳定性的关键决定因素。尽管红藻的细菌群落已受到广泛关注，但相关的真菌组，特别是酵母部分，仍缺乏充分表征，尽管有越来越多的证据表明真菌类群参与植物激素信号传导、表面定殖动力学和宿主胁迫耐受性。在本研究中，研究人员表征了与在葡萄牙ílhavo的综合多营养水产养殖（Integrated Multi-Trophic Aquaculture，IMTA）系统中培养的红藻Porphyra dioica五个生命阶段相关的可培养酵母部分。通过直接涂布和富集培养在选择性培养基上，从丝状体（conchocelis）、壳孢子囊（conchosporangia）、幼叶状体（young blade）和成叶状体（adult blade）阶段分离酵母菌株，并通过rRNA基因测序进行分类学鉴定。进一步筛查了分离株的生态和生物技术相关功能性状，包括生长素（auxin）生物合成、生物表面活性剂（biosurfactant）和生物乳化剂（bioemulsifier）生产，以及细胞内脂质积累。共获得21株分离株，鉴定为Rhodotorula mucilaginosa、Naganishia diffluens、Williopsis vartiovaarae、Taphrina sp.和Sporobolomyces roseus，涵盖子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）。酵母回收受到使用过滤但未灭菌海水培养的藻类样品中耐氯霉素细菌过度生长的限制，因此该数据集代表可回收的可培养部分。群落结构受宿主发育阶段影响：N. diffluens从丝状体阶段分离，R. mucilaginosa从壳孢子囊阶段分离，而在接近收获的成叶状体中观察到从子囊菌类群（W. vartiovaarae、Taphrina sp.）向有色担子菌酵母（N. diffluens、S. roseus）的转变。若干分离株产生生长素、生物表面活性剂和生物乳化剂，并积累细胞内脂质，支持其作为工业大藻培养中益生菌以及增值生物产品候选菌株的潜在作用。本研究首次揭示了与工业培养的P. dioica相关的可培养酵母群落，并为未来研究酵母在IMTA系统中大藻表现中的作用奠定了基础。

**论文解读文章：养殖红藻Porphyra dioica不同生命阶段相关的可培养酵母及其功能潜力**

**1. 研究背景与问题**

大藻（macroalgae）是光合作用的水生真核生物，作为初级生产者、栖息地形成者和营养循环调节者发挥核心生态作用，同时在食品、饲料、肥料、化妆品和生物活性化合物等领域具有日益增长的经济价值。大藻水产养殖被视为可持续的生物质来源，因其无需耕地和淡水灌溉，并能促进循环水产养殖系统中的营养生物修复。然而，仅有少数大藻物种拥有稳定且可扩展的培养方案，生产常受环境变异、疾病、繁殖瓶颈和早期发育阶段控制不完善等因素制约。

大藻以全生物体（holobiont）形式与细菌、古菌、真菌、酵母、原生生物和病毒共生，这些微生物可贡献于营养获取、形态发生、附着、胁迫耐受、病原防御和环境变化适应。细菌作为大藻微生物组中研究最充分的部分，能产生维生素、铁载体、群体感应分子和形态发生因子，参与藻类生长、孢子萌发、藻体发育和抗病性。相比之下，真菌部分，尤其是酵母，仍相对未被充分探索，多数研究仅通过分离培养或更广泛的真菌多样性调查进行。

近期证据支持酵母在水生光合系统中有功能相关性，而非被动污染物。在微藻实验室和工业培养中，酵母及其类似真菌可能影响营养可利用性、有机物周转、聚集、氧化应激响应和培养稳定性。此外，从工业微藻培养中分离的酵母可产生生态和生物技术相关代谢物，包括脂质、生长素、生物表面活性剂、生物乳化剂和色素。然而，酵母在大藻全生物体中的作用，尤其是不同宿主发育阶段的作用，仍了解甚少。

Porphyra dioica是一种红藻，属于红毛菜目（Bangiales），该目包含一些经济上最重要的食用海藻，广泛用于紫菜及类似产品。其异型生活史在单倍体配子体叶状体与二倍体孢子体丝状体阶段之间交替，这种异型生活史给水产养殖带来挑战，因每个发育阶段具有不同的生理需求，且可能对环境胁迫、微生物定殖和疾病的易感性不同。大藻微生物组随宿主物种、组织类型、季节、地理、环境条件和发育阶段而变化。在红毛菜目藻类中，配子体与孢子体阶段在形态、生理、表面特性和培养条件上的显著差异预计会影响微生物的招募和持续存在。阶段特异性微生物组可能影响孢子萌发、丝状体生长、叶状体形成和苗圃表现等关键过程。然而，酵母是否与P. dioica特定阶段持续关联、其多样性在生活史期间是否变化、以及不同阶段分离株是否展示与宿主发育或水产养殖表现相关的性状，仍基本未知。

在可能参与酵母-藻相互作用的性状中，生物表面活性剂、生物乳化剂、生长素和脂质生产尤为值得关注。生物表面活性剂和生物乳化剂可增加疏水底物生物可利用性，影响生物膜结构，调控微生物附着与脱落，并促进微生物群落内的拮抗相互作用。生长素调节陆地植物细胞分裂、伸长和分化，在藻类（包括红藻）中也有生长素样效应报道，中等浓度可能影响生长和发育。酵母的脂质积累与碳储存和周转相关，并可能提供高价值化合物。这些性状为评估与大藻相关的可培养酵母是否具有全生物体内的功能潜力提供了有用框架。

本研究旨在表征在葡萄牙ílhavo的ALGAplus公司基于陆基综合多营养水产养殖（Integrated Multi-Trophic Aquaculture, IMTA）系统中培养的Porphyra dioica不同生活史阶段相关的可培养酵母群落。在该系统中，来自高营养级生产单元的水用于培养低营养级生物，促进营养循环并减少环境影响，无需使用人工农药或肥料。研究人员从P. dioica不同发育阶段分离酵母，进行鉴定，并筛查脂质积累、生物表面活性剂和生物乳化剂生产、生长素生产及在替代碳源上生长等具有潜在生态和生物技术相关性的性状。通过将酵母多样性与藻类发育阶段及功能潜力联系起来，本研究填补了P. dioica微生物组中一个被忽视的组分，并有助于更广泛理解酵母在培养海洋藻类系统中的作用。

**2. 研究内容与结论**

研究人员从P. dioica的五个生命阶段（丝状体S1、壳孢子囊S2、幼叶状体S3、成叶状体S4和S5）中分离可培养酵母，通过rRNA基因测序进行分子鉴定，并筛查脂质、生长素、生物表面活性剂和生物乳化剂生产等功能性状。共获得21株酵母分离株，属于Rhodotorula mucilaginosa、Naganishia diffluens、Williopsis vartiovaarae、Taphrina sp.和Sporobolomyces roseus五个物种，涵盖子囊菌门和担子菌门。酵母回收受限于使用过滤但未灭菌海水培养的样品中耐氯霉素细菌的过度生长。群落结构受宿主发育阶段影响：S1阶段仅分离到N. diffluens，S2阶段仅分离到R. mucilaginosa；S4阶段分离到W. vartiovaarae和Taphrina sp.（子囊菌），S5阶段分离到N. diffluens和S. roseus（担子菌），呈现从子囊菌向有色担子菌的转变。功能筛查显示，所有测试分离株均能产生生长素（R. mucilaginosa产量最高）、生物表面活性剂/生物乳化剂，且多数能积累细胞内脂质（R. mucilaginosa和W. vartiovaarae产量较高），但N. diffluens分离株间存在菌株水平变异。该研究首次提供了工业培养P. dioica可培养酵母群落的信息，并表明酵母在IMTA系统中可能具有益生菌和生物技术产品开发潜力。论文发表在《Frontiers in Microbiology》。

**3. 主要关键技术方法**

样品来源于葡萄牙ALGAplus公司IMTA系统中培养的P. dioica，共五个生命阶段（S1–S5）：S1（丝状体母培养）、S2（壳孢子囊）、S3（幼叶状体）在室内光生物反应器中培养，使用灭菌或过滤海水；S4和S5（成叶状体）在室外培养池中培养，使用过滤但未灭菌海水。酵母分离采用直接涂布和富集培养（YPD-Chl和WLN-Chl培养基，含氯霉素抑制细菌），通过形态观察挑选不同菌落，经纯化后，利用D1/D2区及内转录间隔区（ITS）的rDNA序列扩增和NCBI BLAST比对进行分子鉴定，并构建系统发育树。功能筛查中，将分离株在含葡萄糖的最小培养基中培养，通过尼罗红染色测定脂质积累（相对荧光单位），通过Salkowski试剂法测定生长素产量，通过油圈扩散试验和乳化指数评估生物表面活性剂/生物乳化剂生产。

**4. 研究结果**

**3.1 Culturable yeasts obtained from P. dioica culture samples**
通过直接涂布和富集培养，从五个样品中共获得21株酵母分离株，经D1/D2和ITS序列鉴定为五个物种，包括担子菌门的R. mucilaginosa、N. diffluens、S. roseus和子囊菌门的W. vartiovaarae、Taphrina sp.。多数分离株通过富集培养获得，仅IST654（R. mucilaginosa）和IST669（Taphrina sp.）来自直接涂布。S1阶段仅分离到N. diffluens（4株），S2阶段仅分离到R. mucilaginosa（7株），S3阶段因细菌过度生长未分离到酵母，S4阶段分离到W. vartiovaarae（6株）和Taphrina sp.（1株），S5阶段分离到N. diffluens（1株）和S. roseus（1株）。Taphrina sp.仅鉴定到属水平，因ITS和D1/D2序列与多种Taphrina物种相似性高，且该属内种间变异低。

**3.2 Production of biotechnologically and ecologically relevant compounds by yeast isolates**
对20株分离株（除Taphrina sp.）进行功能筛查：
- **脂质积累**：尼罗红染色显示，R. mucilaginosa和W. vartiovaarae所有分离株均积累高水平脂质，接近阳性对照Rhodotorula toruloides的水平；N. diffluens分离株中，来自S1的菌株脂质产量高，但来自S5的IST671产量较低；S. roseus IST724产量中等。
- **生长素生产**：所有分离株均产生生长素，R. mucilaginosa平均产量最高（约13 μg/mL），其次为S. roseus（11.2 μg/mL），W. vartiovaarae和N. diffluens产量较低。
- **生物表面活性剂/生物乳化剂生产**：油圈扩散试验和乳化指数测定显示，所有测试分离株均具有生物表面活性剂/生物乳化剂活性，但S. roseus IST724活性较低。

**5. 讨论与结论**

讨论部分指出，本研究首次描述了IMTA系统中培养的P. dioica可培养酵母部分。酵母回收数量有限且多数经富集获得，表明酵母丰度低或难以回收，尤其S3–S5阶段因耐氯霉素细菌过度生长而受限。酵母群落结构受宿主发育阶段和培养条件共同影响：S1和S2阶段使用灭菌海水，分别仅分离到N. diffluens和R. mucilaginosa，可能反映丝状体向壳孢子囊转变中的生理变化；S4和S5阶段使用过滤但未灭菌海水，从子囊菌（W. vartiovaarae、Taphrina sp.）向有色担子菌（N. diffluens、S. roseus）的转变与叶状体成熟过程中的生态演替一致，后期担子菌可能更适应户外培养中的氧化胁迫和营养波动。功能筛查显示，这些酵母具有生长素、生物表面活性剂/生物乳化剂和脂质生产能力，提示其在藻类表面可能参与营养转化、生物膜调控和碳储存，并具有作为益生菌和增值生物产品候选菌株的潜力。研究结论部分总结如下（翻译）：

总之，本研究首次对工业培养的P. dioica不同生命阶段的可培养酵母部分进行了初步表征。尽管样品和分离株数量有限以及培养条件的影响限制了广泛的生态推论，但阶段相关的酵母类群回收表明P. dioica的真菌组在生活史中是动态变化的。这些发现为未来研究酵母在大藻水产养殖中的功能作用及其对IMTA系统性能和稳定性的可能贡献提供了基础。此外，本研究对酵母分离株脂质、生物表面活性剂和生物乳化剂生产的筛查揭示这些能力是常见特征，并凸显了其有前景的生物技术潜力。