应激响应性伏隔核多巴胺D2受体表达神经元调节可卡因诱导的行为敏化

《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Stress-responsive nucleus accumbens dopamine D2 receptor-expressing neurons modulate cocaine-induced behavioral sensitization

　　

摘要：尽管应激和可卡因都在伏隔核核心（NAcc）中诱导强烈的可塑性，但这些不同经历如何在细胞水平上相互作用以塑造行为仍不清楚。在此，研究人员研究了NAcc多巴胺D₂受体表达的中型棘突神经元（D2R-MSNs）在整合应激和药物诱导信号中的作用。D2R-MSNs显示出不同的活动反应，在束缚应激期间活动增加，而在重复可卡因暴露后活动减少。使用Cre依赖性稳健活动标记（cRAM）系统，研究人员发现可卡因暴露抑制了先前被应激招募的D2R-MSNs亚群的活动。在戒断期间对这些应激标记的D2R-MSNs进行光遗传学重新激活，减弱了可卡因诱导的行为敏化的表达。对应激响应性D2R-MSNs的转录组分析确定了胆囊收缩素（Cck）作为与这种神经元操作相关的候选分子。后续实验表明，可卡因暴露增加了NAcc D2R-MSNs中CCK的表达，而条件性Cck敲低降低了行为敏化的表达。总之，这些发现表明应激响应性D2R-MSNs有助于调节可卡因诱导的行为敏化，并且NAcc D2R-MSNs中的CCK信号可能参与这一过程。

论文解读文章

研究背景与问题：可卡因等精神兴奋剂的慢性暴露会破坏伏隔核核心（NAcc）的神经环路，诱导适应不良的可塑性，表现为行为敏化。各种形式的应激会强力调节精神兴奋剂敏化的获得和表达，增加个体对成瘾的易感性。然而，尽管已知应激和可卡因均诱导NAcc的可塑性，但它们在细胞水平上如何相互作用以影响行为仍不清楚。NAcc的输出主要由多巴胺D₁受体（D1R）和D₂受体（D2R）表达的中型棘突神经元（MSNs）调控，这两类神经元对行为发挥互补但相反的作用。D2R-MSNs通常对奖赏导向行为提供抑制性控制，而增强其谷氨酸能驱动可限制药物摄入。以往研究主要针对广泛的、未筛选的D2R-MSN群体，因此尚不清楚被应激直接激活的特定D2R-MSN亚群如何适应后续可卡因暴露，以及这一功能性亚群是否驱动行为敏化。为了解决这一问题，研究人员利用活动依赖性标记系统结合光遗传学和转录组学分析，选择性研究了NAcc内应激激活的D2R-MSNs的功能和分子适应。

研究内容与结论：研究人员发现，D2R-MSNs在束缚应激期间活动增加，而在重复可卡因暴露后活动减少，呈现双向反应。通过Cre依赖性稳健活动标记（cRAM）系统，他们发现可卡因暴露抑制了先前被应激招募的D2R-MSNs亚群的活动。在戒断期选择性光遗传学激活这些应激标记的D2R-MSNs，显著减弱了可卡因诱导的行为敏化的表达。对应激响应性D2R-MSNs的转录组分析鉴定出胆囊收缩素（Cck）为与这种神经元操作相关的候选分子。后续实验表明，可卡因暴露增加了NAcc D2R-MSNs中CCK的表达，而条件性Cck敲低降低了行为敏化的表达。这些发现表明应激响应性D2R-MSNs参与调节可卡因诱导的行为敏化，且NAcc D2R-MSNs中的CCK信号可能参与这一过程。该论文发表在《Frontiers in Cellular Neuroscience》。

主要关键技术方法：研究人员使用Cre依赖性稳健活动标记（cRAM）系统（基于pAAV-RAM-d2TTA::TRE-FLEX载体）来标记应激激活的D2R-MSNs，并结合光遗传学（ChR2）进行神经元激活。体内光纤光度记录（GCaMP6s）监测实时钙瞬变。通过荧光激活细胞分选（FACS）分离ChR2-eYFP阳性的应激标记D2R-MSNs，进行批量RNA测序。条件性基因敲低使用AAV-DIO-DSE-mCherry-PSE-shCCK载体。实验使用雄性Drd2-Cre、Drd2-EGFP和Drd1-tdTomato转基因小鼠，购自MMRRC和Jackson Laboratory。

研究结果（保留每个小标题）：

1. 束缚应激和重复可卡因暴露差异影响D2R-MSN活动：通过免疫荧光检测c-Fos表达，发现急性和慢性束缚应激均增加D2R-MSNs中c-Fos阳性细胞比例，而D1R-MSNs仅对急性应激有反应。重复可卡因暴露（5天，15 mg/kg）后，D1R-MSNs中c-Fos表达升高，而D2R-MSNs中c-Fos表达相对于盐水处理组降低，提示D2R-MSNs被应激激活而被可卡因抑制。

2. 体内光纤光度法揭示应激和可卡因对D2R-MSNs的相反调节：通过GCaMP6s钙成像，发现束缚应激后D2R-MSNs钙信号显著增加，而可卡因注射后钙信号显著降低，证实了双向活动响应。

3. 重复可卡因暴露降低伏隔核中应激激活的D2R-MSNs的神经元活动：利用cRAM系统标记急性应激激活的D2R-MSNs（dTomato），随后重复可卡因暴露，发现dTomato与c-Fos双阳性细胞数量显著减少，表明可卡因抑制了应激招募的D2R-MSN亚群的活动。

4. 戒断期光遗传学激活急性应激激活的D2R-MSNs降低可卡因敏化的表达：在戒断期每日1小时光遗传学激活（20 Hz，473 nm），发现可卡因处理组中光刺激显著降低了行为敏化的表达，而盐水组无影响。

5. 体内功能验证：慢性应激激活的D2R-MSNs调节可卡因诱导的敏化：慢性束缚应激（14天）后，光遗传学激活慢性应激标记的D2R-MSNs在戒断期同样显著降低了可卡因敏化的表达，与急性应激结果一致。

6. 转录组分析鉴定CCK为急性应激激活的D2R-MSNs中的差异表达基因：通过FACS分离应激标记的D2R-MSNs进行批量RNA测序，比较有/无光刺激的组，鉴定出差异表达基因（DEGs），其中Cck（胆囊收缩素）表现出最显著的下调（log2FC = -6.41，FDR = 27.41），并通过qPCR验证。

7. 可卡因暴露增强NAcc D2R-MSNs中CCK表达：免疫组化显示，在可卡因诱导行为敏化后，D2R-MSNs中CCK阳性细胞数量显著增加，且重复可卡因加戒断组进一步升高。

8. 条件性敲低NAcc D2R-MSNs中的CCK减弱可卡因敏化：通过AAV-shCCK在D2R-MSNs中敲低CCK，发现可卡因诱导的CCK表达降低，且行为敏化的表达显著减弱，但起始阶段的高活动性无变化。

总结讨论与结论：讨论部分指出，D2R-MSNs表现出应激激活和可卡因抑制的差异活动模式，这与以往研究一致。应激激活的D2R-MSN亚群对后续可卡因暴露特别敏感，其活动被抑制。光遗传学恢复这些神经元的活动可减弱行为敏化，提示该功能性亚群可能与抑制可卡因诱导的行为适应相关。转录组分析发现CCK可能是关键分子，可卡因暴露增加D2R-MSNs中CCK表达，而CCK敲低模拟了光遗传学效应，但需注意敲低靶向广泛D2R-MSN群体而非仅应激激活亚群。CCK作为神经肽可能通过调节D2R-MSNs的内在兴奋性和突触可塑性参与行为敏化表达。研究结论：总之，这项研究表明，应激激活的D2R-MSN群体参与应激相关的可卡因相关行为。此外，这些发现提示CCK可能调节D2R-MSN亚群内的敏化表达。这些结果强调了在特定神经群体内应激响应性神经活动与药物相关行为变化之间的潜在联系。