单核细胞增生李斯特菌生长边界的建模：聚焦菌株变异性和有机酸

《Journal of Food Protection》：Modelling the growth boundaries of Listeria monocytogenes: focus on strain variability and organic acids

　　

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一个主要的食品安全问题，尤其是因为它能够在广泛的环境条件下生长。由于该病原体通常需要较高的感染剂量才能致病，因此描述其生长边界随温度、pH、水活度（a_w）以及防腐剂（如有机酸）变化的可靠模型对于准确的风险评估至关重要。本研究提出一个基于“交互项”的生长/非生长模型，用于描述八个环境因素（温度、pH、a_w、乳酸、醋酸、山梨酸、丙酸和柠檬酸）的影响。在该模型中，尽可能用统计分布替代菌株依赖性模型参数的单一值，从而能够描述单核细胞增生李斯特菌生长能力内的种内变异性。乳酸、醋酸、丙酸和柠檬酸的最小抑菌浓度（MIC）分布分别基于33、14、9和8种不同李斯特菌菌株的数值。山梨酸的可获得信息有限，其分布来自文献中检索到的两个MIC值。为了模型评估，进行了文献综述，以汇编单核细胞增生李斯特菌的生长/非生长数据，主要来自培养基，但也包括模型食品基质和食品产品（乳制品、海鲜和肉制品）。总共在培养基中汇编了3060个生长/非生长数据，在模型食品和食品产品中汇编了622个数据。模型对从“非生长”到“可能生长”转变的预测通常提供了正确或安全失效的预测。食品产品中的一些“安全失效”预测与腌制或高浓度乳酸菌的存在有关。进一步的模型验证将是必要的，尤其是对于柠檬酸和丙酸，这些数据缺口已被确认。

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种重要的食源性病原体，因其能在极宽温度（-1.5至45°C）和pH（4.3至9.4）范围内生长而构成显著危害。欧盟法规（EC）No 2073/2005及其更新版（EU）2024/2895对即食（RTE）食品提出了严格要求，要求食品经营者通过货架期研究（如挑战试验和生长潜力评估）及可靠的预测微生物学模型，科学证明产品中该病原体浓度在货架期内始终低于100 CFU/g或完全不存在。现有预测模型通常基于有限菌株，且未充分整合有机酸（如乳酸、醋酸、山梨酸、丙酸和柠檬酸）的抑制作用及菌株间变异性。为弥补这一空白，研究人员开展了这项研究。

研究人员通过广泛文献检索，收集了不同李斯特菌菌株的生长参数（如最低温度T_min、最低pH pH_min、最低水活度a_wmin）及五种有机酸（乳酸、醋酸、山梨酸、丙酸和柠檬酸）未解离形式的最小抑菌浓度（MIC），并基于这些数据定义了模型参数的统计分布（正态分布或Beta-PERT分布）。在此基础上，构建了一个基于“交互项”（ψ值）的随机生长/非生长模型，利用蒙特卡洛模拟生成预测。模型在培养基（3060条记录）和食品基质（622条记录，包括乳制品、海鲜和肉制品）中进行了评估，采用阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和正确预测百分比（CPP）等指标。该研究发表在《Journal of Food Protection》，首次同时考虑了菌株变异性和多种有机酸对单核细胞增生李斯特菌生长边界的影响，为食品安全风险评估和货架期预测提供了更准确、更保守的工具。

**主要关键技术方法**：研究人员采用基于交互项（ψ值）的数学模型，通过文献综述收集了37个菌株的T_min、17个菌株的T_opt、T_max和T_mes、18个菌株的pH_min、32个菌株的a_wmin，以及33、14、9、8个菌株的乳酸、醋酸、丙酸、柠檬酸未解离MIC，山梨酸基于2个文献值。使用正态分布或Beta-PERT分布定义参数分布，并利用Henderson-Hasselbalch方程计算未解离酸浓度。模型评估通过蒙特卡洛模拟（10,000次迭代）进行，数据来源包括ComBase数据库、14篇同行评审论文、4篇博士论文及IZSLER数据库等。

**研究结果**：

**Distributions of the model parameters（模型参数分布）**：通过文献检索，研究人员获得了各参数的统计分布。T_min均值为-1.68°C，T_opt为38.14°C，T_max为43.13°C，pH_min为4.45，a_wmin为0.924。乳酸未解离MIC（MIC_ULAC）均值为5.01 mM，醋酸未解离MIC（MIC_UACET）范围为6.2-33.0 mM。这些分布反映了菌株间的变异性，例如醋酸MIC的变异性最高。

**Datasets for the evaluation of growth/no growth（用于评估生长/非生长的数据集）**：研究人员汇编了培养基数据集3060条记录（其中1692条涉及有机酸）和食品数据集622条记录（其中523条涉及有机酸）。培养基数据中乳酸研究最多（1081条），而柠檬酸（24条）和丙酸（67条）数据较少。食品数据集补充了混合酸数据（169条），但柠檬酸和丙酸数据仍有限。

**Evaluation of the model for growth boundaries of Listeria monocytogenes in broth（培养基中单核细胞增生李斯特菌生长边界模型的评估）**：模型预测与培养基实验数据吻合良好，正确预测百分比（CPP）为96.4%，PPV为97.2%，NPV为94.6%。42个危险失效预测中，14个为异常值（如a_w <0.915或温度>46°C），22个在pH测量分辨率（0.1单位）内。模型捕捉了有机酸存在时最低pH升高（即抑制作用增强）的趋势，且在不同温度下表现一致。

**Evaluation of the model for growth boundaries of Listeria monocytogenes in food（食品中单核细胞增生李斯特菌生长边界模型的评估）**：在食品数据集中，PPV为94.9%，NPV为93.2%。6个危险失效预测中，4个在pH测量分辨率内，2个与里科塔奶酪（ricotta cheese）中柠檬酸效应被高估有关。42个安全失效预测中，28个涉及腌制或烟熏产品，部分与高浓度乳酸菌的存在相关。模型对混合酸的处理（基于Mejlholm和Dalgaard的φ_acid项）表现良好，但引入解离酸项（仅对乳酸）改善了含乳酸盐食品的预测。

**Methodological aspects and future developments（方法学方面与未来发展）**：研究人员强调使用水相中有机酸浓度（而非总质量浓度）作为输入，并建议在食品表征中包括水分、脂肪含量及内源乳酸浓度。文献检索显示不同有机酸的菌株数据不平衡，建议未来研究更多菌株以增强MIC分布稳健性。模型采用“混合”策略（同时利用培养基和食品数据）可弥补食品数据不足，但柠檬酸和丙酸的数据缺口仍需填补。未来可集成Gamma型生长模型，并考虑其他抑制剂（如多酚）及背景微生物群的影响。

**讨论与结论**：研究人员指出，模型在食品中的预测表现良好，但腌制和乳酸菌的存在可能导致安全失效预测，需扩展模型参数。现有数据对柠檬酸和丙酸的支持有限，模型输出需谨慎解读。此外，缺乏混合有机酸的系统性研究，建议开展更多挑战试验，尤其在植物基产品中。未来可利用人工智能（AI）和大语言模型（LLMs）系统化数据收集，并整合动态环境中的生长动力学。

**结论（翻译）**：通过文献检索收集了未解离有机酸的参数值和最小抑菌浓度（MIC），以提出这些参数的分布。这些信息为基于“交互项”的概率方法奠定了基础，用于模拟单核细胞增生李斯特菌的生长/非生长边界。据研究人员所知，这是首个考虑多种环境因素和菌株变异性来预测单核细胞增生李斯特菌生长限制的模型。尽管仍需在扩展数据集上进行评估，该模型与培养基和多种食品基质中收集的实验数据显示出合理的一致性。虽然本研究主要关注生长边界，但预测食品基质中的最大比生长速率（μ_max）仍是重要的下一步。未来研究将聚焦于扩展食品基质数据库，开发一个广泛的生长模型，以模拟单核细胞增生李斯特菌在多种有机酸存在下的生长，并可能整合额外环境因素（如腌制效应和/或抗氧化化合物），并与现有生长模型进行基准比较。