《HUMAN MUTATION》：Integrated Analysis of Single-Cell and Bulk RNA-Seq Reveals ZFP36 as a Novel Endothelial Biomarker for Precision Oncology in Bladder Cancer
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背景：膀胱尿路上皮癌（BLCA）以广泛的基因组不稳定性和复杂的肿瘤微环境重塑为特征。尽管内皮细胞相关基因已被牵涉到癌症进展中，但它们在BLCA中的突变谱、拷贝数改变及突变相关的生物学后果仍未被充分定义。
方法：研究人员整合了来自TCGA-BLCA和多个GE
背景：膀胱尿路上皮癌（BLCA）以广泛的基因组不稳定性和复杂的肿瘤微环境重塑为特征。尽管内皮细胞相关基因已被牵涉到癌症进展中，但它们在BLCA中的突变谱、拷贝数改变及突变相关的生物学后果仍未被充分定义。
方法：研究人员整合了来自TCGA-BLCA和多个GEO队列的单细胞RNA测序、批量转录组谱、体细胞突变数据、拷贝数变异（CNV）信息和临床数据集。通过单细胞分析鉴定内皮细胞相关基因，并与BLCA相关差异表达基因取交集。系统评估了体细胞突变模式、单核苷酸变异类型、CNV分布和生存关联。进一步利用ZFP36改变状态将患者分为改变组和未改变组，随后进行差异表达、GO和KEGG富集分析。使用独立队列评估预后相关性和免疫治疗反应，并在BLCA细胞系中检查了功能效应。
结果：13个内皮相关基因在BLCA中显示出可检测的体细胞突变或CNV。突变分析揭示了DUSP1、CXCR4、JUN、DNAJB4、HSPA1A、CREM、RGS2和ZFP36的反复改变，其中错义突变是主要变异类型，C>T转换是主要SNV类别。CNV分析显示这些基因存在杂合和纯合扩增/缺失事件。ZFP36改变发生在约6%的BLCA样本中，主要代表为扩增。与ZFP36未改变组相比，改变组表现出独特的转录变化，富集于错配修复、白细胞跨内皮迁移、FcγR介导的吞噬作用、免疫效应过程、上皮分化和T细胞活化。临床上，ZFP36表达与预后、内皮浸润和免疫检查点阻断反应相关。
结论：本研究定义了BLCA中内皮相关基因的突变和CNV景观，并确定ZFP36改变为一种与免疫和内皮调节通路相关的突变相关分子特征。这些发现提供了以突变为中心的证据，支持ZFP36作为BLCA分层的候选生物标志物。
膀胱癌内皮细胞相关基因的综合分析：ZFP36作为新型预后与免疫治疗生物标志物
膀胱尿路上皮癌（BLCA）是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，具有高复发率和强异质性，其临床治疗和管理面临巨大挑战。传统批量RNA测序只能反映组织整体的平均基因表达水平，难以揭示肿瘤微环境（TME）中关键细胞群的多样性。单细胞RNA测序（scRNA-seq）的出现使研究人员能够在单细胞分辨率下解析肿瘤生态系统，识别在肿瘤进展中起关键作用的特定细胞亚群。内皮细胞作为基质成分，不仅构成支持肿瘤生长的血管系统，还通过分泌血管分泌因子参与代谢重塑、免疫细胞募集和免疫逃逸。然而，内皮细胞异质性对BLCA免疫微环境和临床结局的具体影响仍不清楚。此外，内皮细胞相关基因在BLCA中的体细胞突变谱、拷贝数变异（CNV）及其生物学后果尚未被充分定义。因此，研究人员整合单细胞与批量转录组数据，系统探索内皮细胞相关基因的突变、CNV、预后价值及免疫治疗意义，并鉴定关键生物标志物，以期为BLCA的精准预后评估和个性化治疗提供新策略。该研究成果发表于《HUMAN MUTATION》。
研究人员首先利用GSE149652数据集中22例BLCA样本进行scRNA-seq分析，经质量控制、批次效应校正和细胞注释，鉴定出7个细胞群。随后，将单细胞来源的内皮细胞相关基因与TCGA-BLCA肿瘤与正常组织的差异表达基因取交集，获得19个核心预后基因。基于这些基因，采用非负矩阵分解（NMF）进行分子分型，并结合机器学习算法（XGBoost和SHAP）筛选出核心基因ZFP36。通过多个独立GEO队列和免疫检查点阻断（ICB）治疗队列验证了ZFP36的预后和免疫治疗预测价值。同时，利用cBioPortal和GSCA数据库分析了内皮相关基因的体细胞突变和CNV景观，并比较了ZFP36改变组与未改变组的转录组差异和通路富集。最后，在BLCA细胞系T24和UMUC3中通过siRNA敲低实验验证了ZFP36的功能。
主要技术方法包括：单细胞转录组分析（GSE149652，22例BLCA样本，HARMONY算法去批次效应，FindMarkers鉴定标记基因）；NMF共识聚类（TCGA-BLCA队列）；XGBoost机器学习结合SHAP解释；基于cBioPortal和GSCA的体细胞突变与CNV分析；scTenifoldKnk虚拟基因敲除分析；多个GEO队列（GSE69795、GSE39281、GSE13507、GSE19423）和ICB队列（Hugo 2016、Kim 2019、Cho 2020）的预后与治疗反应验证；以及T24和UMUC3细胞系的体外功能实验。
研究结果如下：
3.1 单细胞分析筛选内皮细胞相关标记基因：通过对22例BLCA样本的scRNA-seq分析，成功鉴定出巨噬细胞、内皮细胞、活化CD8
+ T细胞、耗竭CD8
+ T细胞、B细胞、T细胞和NKT细胞共7个细胞群，为后续内皮细胞相关基因的筛选奠定了基础。
3.2 内皮细胞标记基因功能分析：ReactomeGSA和GO富集分析显示，内皮细胞群（C5）显著富集蛋白折叠、未折叠蛋白结合等应激反应相关通路；GSEA进一步显示p53和TNF-α/NF-κB信号通路富集，而氧化磷酸化显著负富集，提示该内皮亚群发生了代谢重编程和炎症应激激活。
3.3 鉴定BLCA内皮细胞相关预后特征：TCGA-BLCA差异表达基因与内皮基因取交集获得19个核心基因，单因素Cox回归显示其中多数基因（如DNAJB4、JUN、RGS2、ZFP36）为风险因子，而ID2、HSPE1为保护因子；差异表达分析证实这些基因在肿瘤组织中显著失调。
3.4 内皮相关基因体细胞突变和CNV景观：在13个可分析的内皮相关基因中，25例突变阳性样本以错义突变为主，SNV类别以C>T转换最常见；DUSP1突变频率最高（20%），CXCR4和JUN各16%，ZFP36为8%。CNV分析显示杂合事件较纯合事件更常见，ZFP36改变以扩增为主。
3.5 基于NMF的分子亚型显示不同预后模式：NMF算法将TCGA-BLCA样本分为两个亚型（C1和C2），其中C1亚型总生存期显著差于C2亚型，且在三分类时也呈现稳定差异。
3.6 分子亚型的临床病理和基因组特征：C1亚型与晚期T分期、更高组织学分级和更差TNM分期显著相关；突变景观显示C1亚型TP53突变频率更高（51% vs. 45%）；TIDE分析提示C1亚型免疫逃逸能力更强，可能对免疫治疗反应较差。
3.7 机器学习鉴定ZFP36为核心预后生物标志物：XGBoost模型和SHAP分析将ZFP36列为最重要的预测特征之一；在GSE69795、GSE39281、GSE13507和GSE19423四个独立GEO队列中，高ZFP36表达与更长总生存期显著相关，低表达与晚期T分期、N分期和高级别相关；虚拟敲除分析提示ZFP36可能参与氧化应激调控。
3.8 ZFP36塑造TME并预测免疫治疗反应：免疫浸润分析显示ZFP36表达与内皮细胞浸润强正相关；在Hugo 2016、Kim 2019和Cho 2020三个ICB治疗队列中，高ZFP36表达患者经抗PD-1/PD-L1治疗后总生存期和无进展生存期显著延长；单细胞数据（GSE130001）证实ZFP36主要表达于内皮细胞和成纤维细胞等基质成分。
3.9 ZFP36基因组改变相关的转录组变化和通路富集：TCGA BLCA中约6%样本存在ZFP36改变，主要为扩增；改变组与未改变组相比，差异基因富集于白细胞跨内皮迁移、FcγR介导的吞噬作用、错配修复、免疫效应过程、T细胞活化、上皮分化等通路，提示ZFP36改变与免疫-内皮重塑相关。
3.10 敲低ZFP36抑制BLCA细胞增殖和转移：在T24和UMUC3细胞系中，siRNA介导的ZFP36敲低显著降低了细胞集落形成能力、迁移能力和侵袭能力，表明ZFP36在BLCA细胞中发挥抑癌作用。
讨论部分指出，内皮细胞异质性在BLCA进展中具有重要作用。ZFP36作为RNA结合蛋白，通过结合mRNA的AU富集元件促进其降解，参与炎症消退和免疫调节。本研究发现ZFP36低表达与晚期临床病理特征和不良预后相关，且虚拟敲除提示其缺失可能破坏氧化应激平衡。NMF亚型分析显示高危C1亚型具有更高的TP53突变频率和TIDE评分，提示免疫逃逸和免疫治疗抵抗。ZFP36改变与免疫-内皮相关通路富集的结果进一步支持其参与TME重塑。此外，研究人员承认研究存在局限性，如回顾性队列来源、缺乏内皮细胞特异性功能实验等。结论部分总结：本研究揭示了内皮细胞异质性在BLCA进展中的重要作用，确定了ZFP36作为与内皮细胞浸润密切相关的候选预后生物标志物；突变/CNV和ZFP36改变相关富集分析进一步支持其与免疫-内皮重塑的关联；分子分型策略为BLCA的预后评估和个性化治疗计划，尤其是免疫治疗策略的选择，提供了理论基础。
