用于紫苏饮料发酵的康普茶微生物的分离

《Food Science & Nutrition》：Isolation of Kombucha Microorganisms for Application in Perilla Beverage Fermentation

　　

越南消费者对康普茶（kombucha）需求的日益增长，促使研究人员开发标准化的微生物发酵剂（starter cultures）用于功能性饮料生产。本研究从5种商业康普茶样本中分离并评估微生物联合体（microbial consortia），使用选择性培养基：酵母提取物蛋白胨甘油葡萄糖（YPGD）培养基用于醋酸菌（AAB），MRS培养基用于乳酸菌（LAB），酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂（YPDA）培养基用于酵母菌。基于形态学和生化特征，共回收22株AAB、6株LAB和9株酵母分离物。序列分析显示，所选菌株与关键物种高度相似：Komagataeibacter saccharivorans、Levilactobacillus brevis和Wickerhamomyces anomalus。使用紫苏（Perilla）提取物进行的实验评估表明，15%蔗糖浓度结合酵母:AAB:LAB接种比例为2:2:1时，发酵动力学表现良好，总黄酮含量（TFC）保留率提高5%–10%，总花青素含量（TAC）在第3天升高300%–400%，2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）抗氧化能力在第6天维持在2.49 mg AAE/mL，优于其他比例。这些结果证实了分离的微生物菌株作为草药饮料发酵有效发酵剂的潜力。研究人员建议进一步研究代谢特性、感官特性和放大生产，以支持工业应用。

**论文解读：越南康普茶微生物分离及其在紫苏饮料发酵中的应用研究**

**研究背景与问题**

康普茶（kombucha）作为一种功能性发酵茶饮料，因其益生菌特性、抗氧化活性和潜在健康益处，在全球范围内需求日益增长。在越南，消费者对康普茶的兴趣显著增加，但国内生产大多依赖来自前一批次或未标准化商业发酵剂的未定义微生物联合体，导致产品质量不一致、发酵曲线不可预测以及潜在的安全隐患。因此，开发标准化、区域特异性的发酵剂对于实现工业化规模的可重复发酵和稳定的功能特性至关重要。尽管已有研究从越南传统发酵产品中分离乳酸菌以增强康普茶功能，但当地商业康普茶微生物群落的全面表征仍然有限。本研究旨在通过系统分离和表征越南市场五种商业康普茶样本中的微生物联合体，并优化其在紫苏（Perilla frutescens）提取物中的发酵接种比例，填补这一空白，为草药饮料标准化发酵提供科学基础。

**研究内容与结论**

研究人员从五种商业康普茶样本中，使用选择性培养基（YPGD用于醋酸菌，MRS用于乳酸菌，YPDA用于酵母菌）进行微生物分离，基于形态学、生化特征和分子鉴定（16S rRNA和ITS测序）筛选出代表性菌株。随后，以紫苏提取物为模型底物，在15%蔗糖浓度下，比较不同酵母:AAB:LAB接种比例（1:1:1、2:1:2、2:2:1、3:2:3）的发酵性能，监测总可溶性固形物（TSS）、pH值、有机酸、乙醇、总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）、总花青素含量（TAC）和DPPH自由基清除活性。研究发现，2:2:1比例（酵母:AAB:LAB）在保留生物活性化合物（TFC、TAC）和维持抗氧化能力方面表现最优，同时产生适量有机酸和乙醇，表明该比例能实现代谢平衡。该研究首次为紫苏基质提供了优化的发酵剂比例，区别于传统茶基系统，并验证了分离菌株作为有效发酵剂的潜力。论文发表在《Food Science》。

**主要关键技术方法**

1. **选择性培养基分离与初筛**：使用YPGD（含CaCO₃）、MRS（含CaCO₃）和YPDA（含氯霉素）培养基，通过菌落形态、革兰氏染色、过氧化氢酶和氧化酶试验区分醋酸菌（AAB）、乳酸菌（LAB）和酵母菌。
2. **分子鉴定**：对筛选菌株进行16S rRNA基因（细菌）和ITS区域（酵母）PCR扩增、测序，并与NCBI GenBank数据库比对。
3. **发酵优化实验**：以紫苏提取物为底物（15%蔗糖），设置不同酵母:AAB:LAB接种比例（1:1:1、2:1:2、2:2:1、3:2:3），在25–30°C半好氧条件下发酵6天，定期分析理化指标和生物活性。样本来源：越南胡志明市超市购买的5种商业康普茶饮品。

**研究结果**

**3.1 乳酸菌的分离**：从样品中分离出37株微生物，包括28株细菌和9株酵母。其中22株AAB（78.6%）呈革兰氏阴性、过氧化氢酶阳性，6株LAB（21.4%）呈革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，9株酵母均为椭圆形细胞。根据表型初步筛选，保留11株AAB、4株LAB和9株酵母进行后续测试。

**3.2 酸和乙醇产生动力学**：通过36小时发酵，LAB分离株L2-1乳酸产量最高（58.5 mg/100 mL）；AAB分离株A2-5乙酸产量最高（12.8 g/L）；酵母分离株Y2-2乙醇产量最高（1.150%）。基于代谢互补性，选择L2-1、A2-5和Y2-2作为构建最小发酵剂的候选菌株。

**3.3 分子鉴定**：16S rRNA测序显示L2-1与Levilactobacillus brevis相似性97.34%；A2-5与Komagataeibacter saccharivorans相似性100%；ITS测序显示Y2-2与Wickerhamomyces anomalus相似性97.98%。这些结果确认了菌株的种属身份，与康普茶常见微生物吻合。

**3.4 接种比例的影响**：
- **3.4.1 对生物活性物质的影响**：在发酵第3天，F4（2:2:1）保留最高TFC（78.26 mg QE/mL）和较高TPC（28.64 mg GAE/mL），TAC显著升高（3.88 mg/L，较初始增加300–400%），表明该比例有利于早期花青素释放和类黄酮稳定。第6天，F4仍保持最高TFC（80.72 mg QE/mL）和稳定DPPH活性（2.49 mg AAE/mL），而其他配方（如F2和F5）出现加速损失。F4的TAC在第6天下降但仍高于对照，显示平衡的微生物组成有助于控制酸化和氧化应激，减少花青素降解。
- **3.4.2 对理化性质的影响**：所有接种配方（F2–F5）的TSS逐渐下降，pH降低，还原糖消耗显著（第6天0.71–1.21 mg/mL，对照F1为4.05 mg/mL）。F4的乙酸和乳酸产量最高（第6天分别为9.70 g/L和14.55 g/L），乙醇产量也最高（2.38%），表明2:2:1比例促进了酵母和细菌的协同代谢，实现高效底物转化和酸积累。对照F1无乙醇产生，证实自发发酵能力有限。

**讨论与结论**

研究讨论部分指出，F4（2:2:1）的优越性能归因于其平衡的酵母比例（提供足够乙醇底物）和AAB比例（有效氧化乙醇为乙酸），同时限制LAB比例以避免过度酸化和类黄酮降解。该比例与自然康普茶菌群的共生平衡一致，适用于富含热敏性花青素和酚类的草药基质。研究结论部分总结如下：本研究从越南商业康普茶中分离并表征了有前景的微生物菌株，确定了2:2:1（酵母:AAB:LAB）接种比例配合15%蔗糖，在紫苏提取物中显示出良好的发酵性能和生物活性保留。该结果为开发草药康普茶标准化发酵剂提供了初步证据。然而，在工业应用前，还需要进一步研究，包括感官评价、挥发性化合物分析、微生物动态监测和放大实验。此外，还需解决发酵剂在长期储存中的稳定性、批次间可重复性以及污染控制策略。