Br?nsted碱性小分子激活KRAS-Q61突变体中的GTP水解

《Nature Chemical Biology》：Br?nsted-basic small molecules activate GTP hydrolysis in KRAS-Q61 mutants

　　

RAS致癌基因家族（KRAS、HRAS、NRAS）是人类癌症中最常发生突变的基因之一。治疗开发主要集中在KRAS第12密码子突变的抑制剂上，而针对Q61变异体的突变选择性抑制剂仍然难以获得。G12和Q61突变体的一个共同机制特征是GTP水解效率降低，这导致RAS富集于其活性、信号传导能力强的状态。在此，研究人员报告了作为替代治疗策略的加速KRAS-Q61突变体中GTP水解的小分子。这些化合物通过向活性位点引入一个通用碱基来补偿催化残基Gln61的缺失，选择性增强KRAS-Q61X（X = H、L、K、R）突变体的水解高达20倍。在突变癌细胞系中，这些化合物降低了GTP结合的RAS水平并抑制了下游信号传导。这项工作为小分子“GTP酶激活剂”（GTPase activators）建立了机制基础，并为靶向RAS驱动的癌症提供了新的范式。

**论文解读：Br?nsted碱性小分子作为KRAS-Q61突变体的GTP酶激活剂**

**研究背景与问题**
RAS家族（KRAS、HRAS、NRAS）是人类癌症中最常见的突变致癌基因，全球每年影响超过300万患者。尽管KRAS-G12C抑制剂已取得临床突破，但针对Q61位点突变（如Q61H、Q61L、Q61K、Q61R）的选择性抑制剂仍缺失，构成未满足的临床需求。Q61突变在HRAS和NRAS驱动的癌症（如头颈癌和黑色素瘤）中尤为常见，分别占约60%和85%的病例。G12和Q61突变体的共同机制特征是GTP水解效率降低，导致RAS持续处于活性GTP结合状态，驱动促有丝分裂信号。Q61突变体中，催化残基Gln61的缺失使得内在GTP酶活性和GAP（GTPase-accelerating protein）介导的水解均严重受损，尤其是Q61R突变体完全丧失水解能力。因此，通过恢复GTP水解来促使RAS失活，是一个替代治疗策略，可避免阻断信号传导的常规抑制剂模式，并有望提供更广泛的适用性。

**研究目的与意义**
研究人员受翻译相关GTP酶（如EF-Tu）利用组氨酸残基协调亲核水分子的自然机制启发，提出通过小分子配体向KRAS-Q61突变体的活性位点提供通用碱基，以化学补充方式恢复GTP水解。该研究报道了首类小分子GTP酶激活剂，证明其能选择性加速KRAS-Q61突变体的GTP水解，并在细胞中抑制下游信号。论文发表在《Nature Chemical Biology》，为开发靶向RAS驱动癌症的激活剂策略奠定了概念与机制基础。

**关键技术方法**
本研究主要采用以下关键技术方法：
1. **蛋白质表达与纯化**：通过大肠杆菌表达系统（BL21(DE3)）表达人源KRAS（1-169氨基酸）、HRAS（1-166）、NRAS（1-166）及NF1-GRD（1,203-1,530）等重组蛋白，经镍亲和层析、TEV蛋白酶切、阴离子交换和尺寸排阻色谱纯化，获得高纯度蛋白。
2. **GTP/GppNHp负载与水解检测**：利用EDTA螯合法将蛋白负载GTP或非水解类似物GppNHp，并通过磷酸盐传感器荧光法（Phosphate Sensor assay）和³¹P NMR实时监测GTP水解动力学。
3. **荧光偏振结合实验**：使用MRTX1133-FITC（19）作为示踪剂，测定化合物与不同KRAS突变体（GppNHp或GDP结合态）的亲和力。
4. **细胞生物学实验**：在Rasless MEF（小鼠胚胎成纤维细胞，敲除内源Kras、Hras、Nras基因并表达单一驱动癌基因）和多种人癌细胞系（SW948、Calu-6、NCI-H460、A375）中，通过Raf-RBD pulldown检测GTP-RAS水平，并利用免疫印迹检测下游磷酸化ERK（p-ERK）信号。
5. **X射线晶体学**：解析化合物2与KRAS-Q61K·GppNHp及KRAS-Q61K·GDP的复合物晶体结构，确定配体结合模式与咪唑基团定位。

**研究结果**

**1. Switch-II配体激活KRAS-Q61R GTP水解**
研究人员合成了基于MRTX1133骨架（已知结合KRAS switch-II口袋）并连接咪唑基团的化合物1。在单周转GTP水解实验中，KRAS-Q61K、Q61L、Q61R突变体完全无活性，Q61H活性微弱。化合物1（50 μM）可显著加速KRAS-Q61R·GTP的水解，而天然GAP蛋白神经纤维瘤蛋白1（NF1）和三元复合物抑制剂RMC7977均无效果。该效应特异于GTP结合态，不影响GDP或GppNHp结合态，也不影响游离GTP。通过³¹P NMR直接观察，化合物1处理导致GTP信号随时间减少，同时生成GDP和无机磷酸，而DMSO对照组无变化，证实了水解加速。

**2. GTP酶救援需要适当定位的Br?nsted碱**
为探究机制，合成16种衍生物（1-16），改变咪唑基团的pKa和位阻。甲基化咪唑N1（化合物2）保留活性，甲基化N3（化合物3）完全失活；将亚甲基连接替换为羰基（化合物4）也失活。引入四氮唑、噻唑、噁唑（化合物5-7）降低碱性，活性减弱。吡啶（8）和羧酸（9）等碱性基团仍具活性，支持通用碱催化机制。位阻（甲基、硝基）对活性影响较小。通过分析表观一级动力学常数与计算pKa的关系，发现最佳pKa约为7，且活性与亲核性无关，提示通用酸碱催化而非直接亲核攻击。

**3. 化合物1选择性激活RAS-Q61X的GTP水解**
化合物1以浓度依赖方式加速所有四种KRAS-Q61突变体（Q61R、Q61L、Q61K、Q61H）的GTP水解，最大增强达20倍，但不影响野生型KRAS（WT）、G12D或A59G突变体。荧光偏振实验证实化合物1可结合KRAS-WT，但未激活水解，表明选择性源于Gln61缺失的突变体对催化补偿的需求。由于switch-II配体通过His95与KRAS特异性结合，化合物1对HRAS-Q61R和NRAS-Q61R无活性，但将HRAS的Gln95或NRAS的Leu95突变为组氨酸后，化合物1可显著加速其GTP水解，证明该策略可扩展至其他RAS亚型。

**4. GTP酶激活剂抑制KRAS-Q61X信号传导**
在Rasless MEF细胞（表达KRAS-Q61R）中，化合物2（溶解度更优）以浓度和时间依赖方式降低RAS·GTP水平，并抑制ERK磷酸化（T202/Y204），4小时半数最大抑制浓度（IC₅₀）约10 μM。在HEK-293T细胞中瞬时转染KRAS-Q61K、Q61H、Q61R等突变体后，化合物2同样降低RAS·GTP和p-ERK。在KRAS-Q61L Rasless MEF细胞中效果一致，而BRAF^V600E细胞（无RAS·GTP）p-ERK水平不受影响。在人癌细胞系SW948（KRAS^Q61L）、Calu-6（KRAS^Q61K）、NCI-H460（KRAS^Q61H）中，30 μM化合物2处理4小时降低RAS·GTP和p-ERK，而A375（BRAF^V600E）无变化。这些数据表明化合物2在细胞中作为KRAS-Q61X激活剂，通过促进GTP水解抑制MAPK信号。

**5. 结构生物学机制**
解析了化合物2与KRAS-Q61K·GppNHp（活性状态）和KRAS-Q61K·GDP（非活性状态）的高分辨率晶体结构。化合物2占据switch-II口袋，将Lys61侧链排出，其咪唑基团靠近GppNHp的γ-磷酸，电子密度清晰。与p120GAP结合的HRAS-WT过渡态结构叠合显示，化合物2的咪唑定位于Gln61的相同位置，但未观察到亲核水分子密度。与KRAS-Q61H·GTP结构比较，化合物2的咪唑比His61侧链更接近γ-磷酸，解释了为何能进一步加速此突变体的水解。

**讨论与结论**
讨论部分指出，虽然KRAS-G12C抑制剂已证明直接靶向突变RAS的临床价值，但其他突变体（尤其是Q61）尚无有效疗法。本文通过化学补充策略，利用咪唑等通用碱基精确递送至活性位点，成功恢复GTP水解，提供了一种机制驱动的治疗指数。与RMC7977等通过稳定过渡态加速G12突变体水解的机制不同，本文直接补偿Gln61缺失的催化装置。本研究的局限性包括：当前配体对GTP结合态亲和力低，导致需要较高浓度；化合物对HRAS和NRAS的适用性仅在化学遗传系统（突变95位组氨酸）中验证。随着GTP态选择性抑制剂的进展，这些限制有望克服。研究结论：研究人员建立了小分子GTP酶激活剂（GTPase activators）的概念与机制基础，为RAS驱动癌症提供了新的治疗范式，并可能扩展至其他因GTP水解缺陷导致疾病的小GTP酶。