《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：N-Terminal protein sequencing by nicotinic acid derivatization and MS analysis
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大多数基于质谱（MS）的N端蛋白质序列分析工作流程依赖于对蛋白质N端和赖氨酸残基上伯胺的修饰，在许多情况下通过二甲基化实现。然而，此前已有报道称二甲基标记不完全并产生不希望的副反应，研究人员的实验中也观察到了这些现象。在本研究中，研究人员评估了N端蛋白质衍生化
大多数基于质谱（MS）的N端蛋白质序列分析工作流程依赖于对蛋白质N端和赖氨酸残基上伯胺的修饰，在许多情况下通过二甲基化实现。然而，此前已有报道称二甲基标记不完全并产生不希望的副反应，研究人员的实验中也观察到了这些现象。在本研究中，研究人员评估了N端蛋白质衍生化的替代方法。对于还原二甲基化，高毒性还原剂氰基硼氢化钠被成功替换为吡啶硼烷。此外，研究人员将几种单试剂标记方法应用于模型蛋白质，并与二甲基化工作流程进行了比较。筛选合适试剂的标准包括蛋白质衍生化反应的完全性和选择性、质谱对修饰肽段的检测灵敏度，以及不存在不希望的副反应。比较分析表明，通过烟酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（nicotinic acid N-hydroxysuccinimide ester）对游离胺进行化学衍生化是N端蛋白质测序的一种特别有前景的方法。研究人员优化了使用该试剂在溶液或凝胶中进行蛋白质烟酰化（nicotinoylation）的协议，并成功应用于多种测试蛋白质。
**论文解读：基于烟酸衍生化和质谱分析的N端蛋白质测序方法研究**
**研究背景与问题**
蛋白质N端序列分析是鉴定成熟蛋白质真实N末端及蛋白酶底物的关键手段。传统方法如Edman降解已逐渐被质谱（MS）技术取代，后者不仅能识别游离N端，还能检测多种翻译后修饰（如乙酰化、肉豆蔻酰化等）。然而，大多数基于MS的N端测序工作流程依赖于对蛋白质N端和赖氨酸侧链伯胺的化学衍生化，其中还原二甲基化（reductive dimethylation）应用最广。该方法使用甲醛和氰基硼氢化钠（sodium cyanoborohydride）作为还原剂，但存在以下问题：标记不完全、产生多种副反应（如羟甲基化、氰甲基化、N端环化等），且试剂具有高毒性。此外，副反应可能导致内部肽段被错误标记，造成N端假阳性识别。因此，研究人员旨在评估替代性衍生化方法，以提高标记完全性、选择性、质谱检测灵敏度，并减少副反应。
**研究内容与结论**
本研究系统比较了多种化学衍生化方法，包括还原二甲基化（分别使用氰基硼氢化钠和吡啶硼烷作为还原剂）、RapiFluor-MS试剂、2-吡啶甲醛（2-PCA）、串联质谱标签（TMT）试剂以及烟酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（nicotinic acid NHS ester）。通过分析牛血清白蛋白（BSA）、肌红蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白和β-半乳糖苷酶等模型蛋白，评估了标记效率、选择性、副反应及质谱碎裂行为。结果表明，烟酸NHS酯衍生化方法在标记完全性、选择性、稳定性及质谱碎裂性能上均优于其他方法，并成功优化了溶液和凝胶中蛋白质的烟酰化（nicotinoylation）协议。该研究发表在《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。
**关键技术与方法**
1. **还原二甲基化替代方法**：用吡啶硼烷（pyridine borane）替代氰基硼氢化钠作为还原剂，降低毒性并提高标记效率。
2. **单试剂衍生化方法**：评估RapiFluor-MS（含NHS氨基甲酸酯基团）、2-PCA（选择性标记N端）、TMT试剂（含NHS酯基团）和烟酸NHS酯。
3. **质谱分析**：采用Orbitrap Fusion Lumos Tribrid和Q Exactive Orbitrap质谱仪，进行数据依赖性采集（DDA），使用HCD碎裂模式。
4. **样品处理**：使用FASP或SP3方法进行酶解，使用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。
5. **数据分析**：通过Mascot搜索引擎鉴定肽段，设置半特异性酶切，考虑可变修饰包括单/二甲基化、烟酰化（+105.0215 Da）等。
**研究结果**
**Protein dimethylation**
以BSA为模型蛋白，比较了两种还原剂的二甲基化效率。使用氰基硼氢化钠时，N端肽段完全二甲基化产率为90%；使用吡啶硼烷时产率为96%，且副产物（如甲基醇、氰甲基化、N端环化产物）显著减少。同时检测到内部肽段被单甲基化或二甲基化，可能干扰N端正确识别。
**Selection of new protein derivatization methods**
研究人员设定了试剂筛选标准：仅使用商业试剂、操作简便、标记完全且副反应少。二甲基化保留伯胺碱性，而其他试剂（RapiFluor、TMT、2-PCA、烟酸）通过引入碱性叔胺或吡啶环维持质谱电离效率。
**Preferential or selective labeling of the protein N-terminus**
RapiFluor在pH 6.5下优先标记N端，但产率因蛋白质而异，且MS/MS碎裂中RapiFluor基团不稳定，产生干扰信号（m/z 313和240），降低序列特异性碎片强度。2-PCA选择性标记N端，不修饰赖氨酸，但标记效率低（50–70%），且产物存在两种非对映异构体，导致色谱分离。此外，2-PCA与N端甘氨酸发生醛醇缩合副反应（+107 Da），进一步增加复杂性。因此，两种方法均未被采用。
**Derivatization of all free amino groups of proteins**
TMT试剂对BSA等蛋白的标记接近完全，但存在与酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸的副反应，可能误导N端识别。烟酸NHS酯标记在BSA上达到92%产率，副反应极少，且修饰在HCD条件下稳定，产生丰富的b离子（包括b1），有利于肽段鉴定。
**Nicotinoylation of proteins in solution**
优化条件包括：pH 7.5（HEPES缓冲液）、20 mM烟酸NHS酯、添加4 M盐酸胍变性蛋白、室温反应2小时，后用羟胺和氨水（pH 10）淬灭。优化后，BSA、肌红蛋白、α-S1-酪蛋白N端肽段标记产率≥98%，β-半乳糖苷酶约93%。
**Comparison of protein nicotinoylation and protein dimethylation**
在相同条件下，烟酰化产率98%（标准差0.5%），二甲基化产率95%（标准差0.5%），烟酰化略优。二甲基化的潜在优势是可用LysargiNase酶切二甲基化赖氨酸，但烟酰化整体更稳定且无副产物。
**Nicotinic acid labeling of proteins in gel**
针对凝胶中样品，增加试剂浓度至40 mM，省略盐酸胍，并确保彻底淬灭。BSA、肌红蛋白、α-酪蛋白、β-半乳糖苷酶的N端肽段标记产率在76–92%之间，足以支持鉴定。需使用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶互补酶切以克服肽段长度限制。
**总结与讨论**
论文结论部分指出：蛋白质烟酰化是一种普适性的N端测序衍生化方法，优于还原二甲基化及其他评估方法。烟酰化N端肽段在HCD-MS/MS中产生信息丰富的碎裂图谱，有利于LC-MS/MS鉴定。优化后的溶液和凝胶协议可实现近乎完全或足够高的标记产率，适用于所有测试蛋白。此外，该方法不仅适用于纯化蛋白，也是全蛋白质组N端组学分析的有前景策略。尽管烟酸修饰是首选，但使用甲醛和吡啶硼烷的二甲基化法作为替代工作流程仍有用，因其毒性较低且效率略有提升。选择性2-PCA标记仅在特定应用（如N端附近有赖氨酸残基时）中具优势。
