《Behavioural Brain Research》：Rotenone Exposure in Zebrafish Parkinson’s Disease Model Reveals NURR1–TOP2B Dysregulation and Gut–Brain Axis-Associated Pathology.
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摘要帕金森病是一种进行性神经退行性疾病，早期胃肠道功能障碍和氧化应激通过肠-脑轴在其中的角色日益受到重视。斑马鱼是研究帕金森病的理想模型；然而，据我们所知，目前尚无共识关于哪种罗丹酮浓度能够有效模拟大脑和肠道的病理变化，因此导致引发中枢-外周系统性病理变化的剂量仍未确定。成年斑马
摘要
帕金森病是一种进行性神经退行性疾病，早期胃肠道功能障碍和氧化应激通过肠-脑轴在其中的角色日益受到重视。斑马鱼是研究帕金森病的理想模型；然而，据我们所知，目前尚无共识关于哪种罗丹酮浓度能够有效模拟大脑和肠道的病理变化，因此导致引发中枢-外周系统性病理变化的剂量仍未确定。成年斑马鱼被暴露在2.5或5微克/升的罗丹酮环境中28天，随后对其大脑和肠道的行为、生化、组织学及转录水平变化进行了检测。罗丹酮会引发浓度依赖性的运动功能、类似焦虑的行为以及认知能力下降，其中5微克/升的浓度下这些症状更为明显。在2.5和5微克/升的浓度下，大脑和肠道均出现了组织病理学损伤。氧化应激现象明显，两种浓度下大脑中的活性氧水平均升高，而5微克/升浓度下肠道也会出现这种情况，同时高浓度下脂质过氧化程度也有所增加。包括超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶在内的抗氧化酶活性显著下降。转录分析显示，两种组织中γ1-突触核蛋白和top2b基因的表达上升，而nr4a2a（Nurr1）基因的表达则下降。促炎细胞因子il6和tnfa的水平也显著升高。综上，这些研究结果表明5微克/升的罗丹酮浓度是诱导斑马鱼出现可重复的、系统性的帕金森病样病理变化的最佳剂量，同时也表明NURR1–TOP2B通路的功能紊乱与肠-脑轴相关功能障碍存在关联。
引言
帕金森病是全球第二大常见的神经退行性疾病，影响着数百万人，其带来的全球健康负担正在不断加重[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。该病的典型神经病理学特征包括黑质致密部多巴胺能神经元的进行性退化，以及路易小体中错误折叠的α-突触核蛋白的积累[5]、[6]、[7]。这些病理变化在临床上表现为运动症状，如动作迟缓、静止性震颤和肌强直，同时还伴有抑郁、焦虑、睡眠障碍、胃肠道功能障碍以及认知功能损害等一系列非运动症状[8]、[9]。随着疾病的发展，多达80%的患者会出现痴呆症状，这进一步加重了他们的残疾程度，降低了生活质量[10]、[11]。尽管目前的药物疗法，如左旋多巴、多巴胺激动剂、单胺氧化酶-B抑制剂、儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂、金刚烷胺、抗胆碱能药物以及腺苷A2A受体拮抗剂伊斯特拉地菲林，能够有效缓解运动症状，但这些药物主要只能起到对症处理的作用，无法阻止疾病进展或恢复多巴胺能神经元的功能[12]、[13]、[14]、[15]。因此，迫切需要能够改变疾病进程的策略以及更能准确模拟帕金森病复杂病理生理机制的实验模型。
从1990年到2021年，帕金森病的全球患病率增长了一倍多，预计到2050年这一数字还将超过2500万例，这凸显出该疾病给社会经济带来的日益沉重的负担，也凸显出进一步了解其发病机制的必要性[16]、[17]、[18]。虽然帕金森病传统上被视为一种中枢神经系统疾病，但越来越多的证据表明，它的发病机制涉及胃肠道与大脑之间通过肠-脑轴进行的双向相互作用[19]、[20]、[21]。布拉克假说认为，环境中的毒素或病原体可能首先在胃肠道中引发α-突触核蛋白的错误折叠，随后通过迷走神经和自主神经途径以类似朊病毒的方式传播到大脑[22]、[23]、[24]、[25]。与这一假说相符的是，胃肠道症状，尤其是慢性便秘，往往会在运动功能出现障碍之前出现，而且这些症状与肠道神经系统中的α-突触核蛋白沉积有关[26]。此外，肠道屏障功能的破坏会引发全身性免疫激活，使得包括白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ在内的促炎细胞因子，能够通过破坏血脑屏障以及通过迷走神经传递信号的方式影响中枢神经系统的功能[27]、[28]。这些炎症级联反应会激活胶质细胞，加剧氧化应激和亚硝化应激，进而推动多巴胺能神经元的进行性退化。与此同时，线粒体功能紊乱会增加活性氧的产生，进一步加重氧化应激，促进α-突触核蛋白的错误折叠，提高神经元的脆弱性，从而形成神经炎症和神经退化相互加剧的恶性循环[29]、[30]、[31]。除了上述炎症和氧化机制之外，还有新证据表明，诸如核受体相关因子1（NURR1）和DNA拓扑异构酶IIβ（TOP2B）之类的转录调控因子也与帕金森病相关的神经退化有关。NURR1是多巴胺能神经元发育、存活以及抗炎信号传导的关键调控因子，而TOP2B则负责维持与转录相关的DNA拓扑结构，但在氧化应激环境下可能会引发基因组不稳定。这些通路的功能紊乱越来越被认为与帕金森病中的神经退化过程密切相关[32]、[33]、[34]、[35]。
在现有的实验模型中，斑马鱼因其保留了与人类相似的多巴胺能系统、易于进行遗传操作、身体具有光学透明度，以及适合开展高通量行为、分子和组织病理学分析，而被视为研究帕金森病以及肠-脑轴相互作用的优质脊椎动物模型[36]。罗丹酮作为一种广泛使用的线粒体复合体I抑制剂，可通过引发氧化应激、α-突触核蛋白聚集、神经炎症以及多巴胺能神经元退化等机制，再现帕金森病的多种关键病理特征[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。在斑马鱼中长期暴露于罗丹酮环境中，可以重现帕金森病的运动症状和非运动症状，因此这一模型非常适合用于研究疾病的进展过程。以往针对经罗丹酮处理的斑马鱼中肠-脑轴相关变化的研究，大多使用范围较广的罗丹酮浓度（2–7微克/升），重点关注行为和分子层面的变化[42]、[43]、[44]。这些研究一致显示出运动功能受损、氧化应激、炎症细胞因子释放、α-突触核蛋白积累以及肠道炎症等现象，这些都表明中枢和外周部位的病理变化都参与了帕金森病的发生发展[45]、[46]、[47]。尽管有这些优势，但基于罗丹酮的斑马鱼模型仍存在问题，比如给药方案不够统一，且研究多集中于中枢或外周某一方面的指标，因此尚未明确能够同时引发肠道和大脑病理变化的最佳暴露条件。
因此，本研究系统地分析了斑马鱼在长期暴露于2.5或5微克/升罗丹酮后，其大脑和肠道组织在行为、生化、分子以及组织病理学方面的变化。我们假设，长期接触罗丹酮会在中枢和外周组织中引发剂量依赖性的病理改变，较高浓度的罗丹酮会导致更明显的帕金森病样表型，表现为协调性运动缺陷、氧化应激、组织病理学损伤，以及NURR1和TOP2B通路的功能紊乱。通过综合分析大脑和肠道的功能、生化、分子以及组织病理学指标，本研究全面阐述了罗丹酮在成年斑马鱼中引发的病理变化，同时也为探索与帕金森病神经退化及肠-脑轴功能障碍相关的机制提供了可重复的实验平台。
章节节选
实验动物与处理方法
实验所用的是6–8个月大、平均体重约为0.9克的野生型成年斑马鱼（Danio rerio，AB/AB品系），这些鱼在标准的实验室条件下饲养。它们生活在光照时长为14:10的环境下，温度保持在27±1摄氏度，且饲养环境无疾病存在。所有实验操作均获得了AIMST大学动物伦理审查委员会的批准（审批编号：AUAEC/FOM/2024/03）。
共有75条雌雄混合的斑马鱼被随机分配到三组
病变特征
在大脑中，我们评估了五种组织病理学特征，分别是[1]空泡形成、[2>细胞萎缩、[3]炎症细胞浸润以及[4>嗜酸性细胞质。在肠道中，评估的病变包括[1]炎症细胞浸润、[2>杯状细胞异常以及[3>上皮细胞损伤。大脑和肠道的病变严重程度均按照0（正常）、0.5（非常轻微）、1.0（轻微）、1.5（轻度至中度）、2.0（中度）、2.5（中度至重度）以及3.0这样的标准化等级进行划分
开放场地测试
在斑马鱼暴露于2.5微克/升和5微克/升的罗丹酮之后，我们通过测量它们移动的总距离和平均游泳速度来评估其运动功能。单因素方差分析结果显示，不同组别之间的移动总距离存在显著差异[F [2], [18] = 21.81，p<0.0001]（见图2A）。与对照组相比，暴露于5微克/升罗丹酮的斑马鱼的运动活动显著减少（p<0.0001）。单因素方差分析还显示，整体上存在显著影响
讨论
本研究表明，让成年斑马鱼长期暴露于罗丹酮环境中28天，可使其出现全身性的帕金森病样表现，其中5微克/升的浓度所引发的运动和认知功能障碍、氧化应激、突触核蛋白积累、肠道病变以及转录异常最为明显且具有一致性。这些发现非常重要，因为它们揭示了中枢和外周病变是如何共同发展的，进一步证明了斑马鱼是研究这类疾病整合特征的理想模型
CRediT作者贡献说明
Sharran Raja：软件使用、实验实施。Nurul Syahirah Ahmad Sayuti：实验指导。Dhanveer Ahamed Bathurutheen：初稿撰写、软件使用、项目管理、实验实施、正式数据分析、数据整理。Thenmoly Damodaran：论文审阅与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、实验指导、项目管理、方法设计、实验实施、资金申请、正式数据分析、数据整理、概念构建。Muzaimi Mustapha：论文审阅与
致谢
本研究得到了马来西亚高等教育部基础研究资助计划（FRGS/1/2023/SKK10/AIMST/03/2）的财政支持。同时也要感谢AIMST大学的实验室设施提供的帮助。
Dhanveer Ahamed Bathurutheen|Sharran Raja|Nurul Syahirah Ahmad Sayuti|Muzaimi Mustapha|Thenmoly Damodaran
马来西亚吉打州贝东市08100，AIMST大学应用科学学院
