整合多组学与机器学习技术发现SPI1-METTL16-PLIN4轴可能是HepG2细胞中脂肪变性的驱动因素

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Integrative multi-omics and machine learning identify the SPI1-METTL16-PLIN4 axis as a candidate driver of steatosis in HepG2 cells

　　

摘要

背景

非酒精性脂肪肝病是一种常见的代谢性疾病，目前可用的治疗手段十分有限。本研究旨在在NAFLD的细胞模型中识别潜在的调控因子，并探讨其功能作用。

方法

首先对肝脏转录组数据集GSE126848（31例NAFLD患者 vs 26例对照组）进行WGCNA分析，随后将其与12例NAFLD患者和12名健康对照组的血清蛋白组数据整合。通过三种机器学习算法筛选出核心基因，再在经高果糖（3.2 g/L）和油酸（400 μM）处理48小时的HepG2细胞脂肪变性模型中对这些基因进行功能验证。通过Oil Red O染色以及甘油三酯/总胆固醇检测来评估脂质积累情况，通过ELISA检测TNF-α和IL-6的分泌水平来评估炎症反应，通过流式细胞术检测ROS水平来评估氧化应激状况。通过RNA免疫沉淀结合定量PCR技术验证METTL16与PLIN4 mRNA之间的结合关系，通过甲基化RNA免疫沉淀结合定量PCR技术检测METTL16对PLIN4的m6A修饰作用，最后通过染色质免疫沉淀和双荧光素酶报告基因实验研究SPI1对METTL16的转录调控作用。

结果

综合分析显示PLIN4是核心枢纽基因。在HepG2脂肪变性模型中，PLIN4的表达水平升高（P＜0.001）。在经果糖/油酸处理的HepG2细胞中，敲低PLIN4可减少脂滴积累（P＜0.001），降低TNF-α和IL-6的分泌水平（P＜0.01），同时降低ROS水平（P＜0.001）。从机制上来看，METTL16通过对其m6A修饰来提升PLIN4 mRNA的稳定性。此外，SPI1可通过结合METTL16的启动子来激活其转录表达（P＜0.001）。重新表达PLIN4可部分抵消SPI1敲低对脂质积累（P=0.01）、炎症反应（P＜0.05）以及氧化应激（P＜0.001）的保护作用。

结论

本研究认为SPI1/METTL16/PLIN4轴可能是导致脂肪变性HepG2细胞出现脂肪堆积、炎症反应及氧化应激的潜在调控机制。

引言

非酒精性脂肪肝病是全球范围内极为重要的健康问题，全球约有25%-30%的成年人患有此病，是其最为普遍的慢性肝病之一。该病的特征是在没有大量饮酒的情况下，肝脏内出现过量脂肪堆积。其病情程度从单纯的脂肪变性发展到非酒精性脂肪性肝炎，后者还会伴随炎症、肝细胞损伤和纤维化，甚至可能进展为肝硬化和肝细胞癌。NAFLD的发病机制是脂毒性、线粒体功能障碍、氧化应激以及慢性低度炎症等多种因素共同作用的结果，这些因素共同促进了肝脏脂肪的积累和肝细胞损伤。近年来，植物来源的天然产物和功能性食品因有望改善包括高血脂和NAFLD在内的多种代谢性疾病而受到关注，不过其具体作用机制尚未完全明确。尽管相关研究十分深入，但目前仍没有一种药物被广泛认可可用于治疗NAFLD；现有的治疗方案主要以生活方式干预为主，如控制体重、坚持运动，但这些方法往往难以长期坚持，效果也有限。越来越多的证据表明，NAFLD的进展涉及复杂的分子网络，包括异常的转录程序、紊乱的信号通路以及改变的表观遗传修饰，这些因素都会影响脂质代谢、炎症反应以及细胞的抗应激能力。尽管已有诸多研究进展，但推动NAFLD发生发展的具体分子网络以及关键的调控节点仍不明确。

围脂蛋白4属于围脂蛋白家族，这类蛋白质负责包裹脂滴，它在细胞内的脂质储存和代谢过程中起着关键作用。该蛋白在脂肪周转速度较高的组织中表达量较高，比如脂肪组织、骨骼肌和肝脏。除了在维持脂质平衡方面的常规功能外，PLIN4的功能异常还与肥胖、2型糖尿病以及心血管疾病等多种人类代谢性疾病相关，它会影响脂质的正常储存和能量平衡。在NAFLD背景下，肝脏脂肪变性时PLIN4的表达水平会显著上升。PLIN4含有一个巨大的两亲性螺旋结构，能够直接与中性脂质结合并将其包裹起来，从而替代磷脂单层，稳定脂滴结构。有研究显示，PLIN4会与小型脂滴结合并包裹它们，抑制脂解作用，进而促进肝脏脂肪的积累；而降低PLIN4的表达则可以促进脂解，减少肝脏脂肪含量。在饮食诱导的肥胖小鼠模型中，PLIN4基因缺陷可降低肝脏中的三酰甘油水平，进一步证明了PLIN4在促进肝脏脂肪积累中的作用。在饮食诱导的脂肪性肝炎模型中，肝脏中的PLIN4表达与组蛋白H3K9乙酰化程度的增加以及CBP/BRD4蛋白的结合增强有关。不过，PLIN4在NAFLD发病机制中的确切调控作用，尤其是它对脂质代谢、炎症反应和氧化应激的影响，目前仍不完全清楚。

值得注意的是，环境压力可引发N6-甲基腺苷的修饰，进而导致睾丸莱迪希细胞中的PLIN4 mRNA和蛋白表达水平上升。升高的PLIN4水平又会促进脂滴的形成，随后引发脂质过氧化，进而加剧铁死亡，这样就形成了从m6A修饰到PLIN4介导的脂质积累和氧化损伤的机制链。这一发现表明，类似的m6A介导的调控途径也可能存在于其他代谢组织中，比如NAFLD病变发生的肝脏。甲基转移酶样蛋白16是一种新近发现的RNA m6A甲基转移酶，它能独立识别特定的目标RNA并对其添加甲基。在NAFLD模型中，METTL16的表达水平显著升高，它会通过上调m6A甲基化的脂生成基因CIDEA来推动疾病的发展。SPI1属于ETS家族的主转录因子，负责调控髓系和B淋巴细胞系的发育和功能。近年来，SPI1的表达异常越来越被认为与NAFLD的发病机制有关。例如，在肥胖小鼠的肝脏中SPI1的表达水平会上升，而通过基因或药物手段抑制SPI1的表达，可减轻NAFLD患者的肝脏脂肪变性、炎症反应以及胰岛素抵抗现象。不过，目前还不清楚SPI1是否调控METTL16的转录激活，以及METTL16是否负责对PLIN4 mRNA进行m6A修饰。

整合多组学分析方法能够将转录组、蛋白组和表观基因组的数据相互结合，是揭示疾病发病机制的核心工具。机器学习技术可以帮助从复杂的高维生物数据集中系统地筛选出关键的调控基因和信号通路。本研究正是利用这种整合分析框架，结合NAFLD样本的转录组和蛋白组数据，并运用机器学习技术找出推动疾病进展的关键因子。通过后续的体外实验验证，我们确定了SPI1/METTL16/PLIN4轴可能是导致脂肪变性HepG2细胞出现NAFLD相关表型的潜在机制。这些发现揭示了NAFLD细胞模型中的一个新的调控轴，说明该轴值得进一步研究，有望作为未来治疗的候选靶点。

章节节选

WGCNA分析

研究使用了包含31例NAFLD样本和26例健康对照组的GSE126848数据集，通过WGCNA R包对该数据集进行了分析。在构建无符号邻接矩阵时，需要选择合适的软阈值参数β，这一参数的选择是通过比较不同β值下的无尺度拓扑拟合指数（R2）以及平均连通性来确定的。为了更准确地描述基因间的连通模式，研究人员还生成了拓扑重叠矩阵。

通过WGCNA分析NAFLD中的基因共表达模块

研究对GSE126848肝脏转录组数据集进行了WGCNA分析，旨在系统地识别NAFLD中的基因共表达模式。该数据集包含31例NAFLD患者样本和26例健康对照组样本。通过网络拓扑分析，最终确定最佳的软阈值参数β为22，此时该网络近似呈现无尺度特性（R2=0.808），平均连通性为11.6（见图1A）。在设定0.15的动态树切割高度后，共识别出了11个具有生物学意义的基因共表达模块。

讨论

NAFLD是一种复杂的代谢性疾病，其全球患病率正在不断上升。要明确其具体的分子机制仍是当前面临的重要挑战，这也阻碍了相关治疗方法的研发。因此，人们通常使用高果糖和油酸诱导的肝脏脂肪变性模型来研究NAFLD的发病机制。基于这一成熟的体外肝脏脂肪变性模型，本研究表明SPI1/METTL16/PLIN4轴可能在NAFLD的发病过程中发挥作用。

CRediT作者贡献说明

华为 Bian：软件应用、研究方法设计、数据整理。 黄颖：论文撰写与修改、数据可视化、实验研究、资金申请、研究构思。 肖志洲：论文初稿撰写、实验验证、研究监督、实验资源协调、项目管理、数据统计分析。

伦理审批与参与者同意声明

无需进行伦理审批。

数据可用性

如需获取相关数据，可向相应作者提出合理请求。

利益冲突声明

作者们声明不存在任何可能影响本研究结果的潜在利益冲突或个人关系。

资金支持

本研究得到了广州医科大学“科研能力提升计划”的资助（项目编号：2024SRP056）。

利益冲突声明

?作者们声明不存在任何可能影响本研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

无。

Zhizhou Xiao|Huawei Bian|Ying Huang

中国广州中山大学附属第三医院临床营养科