《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》：Novel peptidomic and in silico insights into taste-related and bioactive peptides from porcine liver (Sus scrofa) protein hydrolyzates
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酶法蛋白水解是一种有前景的策略，用于增值化富含蛋白质的肉类副产品（如猪肝），可生产具有潜在生物活性和味觉增强特性的水解物。先前对猪肝水解物的研究主要集中于游离氨基酸和二肽及三肽，而中等大小肽段（7-25个氨基酸）尽管可能对味觉和生物活性有贡献，但仍未得到充分探
酶法蛋白水解是一种有前景的策略，用于增值化富含蛋白质的肉类副产品（如猪肝），可生产具有潜在生物活性和味觉增强特性的水解物。先前对猪肝水解物的研究主要集中于游离氨基酸和二肽及三肽，而中等大小肽段（7-25个氨基酸）尽管可能对味觉和生物活性有贡献，但仍未得到充分探索。在此背景下，肽组学（peptidomics）结合计算机模拟（in silico）工具为功能肽的鉴定和表征提供了有价值的见解。本研究旨在评估在不同加工条件（包括超声预处理、单酶和顺序水解）下获得的含7-25个氨基酸肽段的猪肝水解物的生物活性和味觉相关潜力。肽组学分析揭示，酶的选择是样品分化的主要驱动因素，其次是水解时间和超声探头预处理。根据UMPred-FRL和BERT4Bitter预测工具，所有水解物组中预测的鲜味肽比例均高于苦味肽。PeptideRanker工具鉴定出92个新的独特肽序列，其生物活性得分高于0.9，其中Protana Prime顺序水解物得分最高。预测的主要生物活性为抗氧化、抗菌、抗糖尿病和抗高血压。在模拟计算机模拟胃肠道消化后，47个肽在BIOPEP-UWM数据库中被关联至18种不同的生物活性，其中抗高血压和抗糖尿病活性尤为突出。总体而言，本研究为7-25个氨基酸肽段对猪肝水解物味觉和生物活性潜力的贡献提供了新见解，促进了其作为功能性食品配料的潜在应用，并有助于肉类副产品的增值化。
论文解读文章
**研究背景与问题**
全球人口增长推动了对高品质蛋白质可持续来源的需求，2024年全球肉类产量达3.74亿吨，其中猪肉产量1.24亿吨，位列第二。然而，肉类加工产生大量屠宰副产品，带来环境和经济挑战。猪肝（*Sus scrofa*）作为可食用副产品，蛋白质含量高（>20 g/100 g），含全部必需氨基酸及维生素和矿物质，其必需氨基酸比例与牛奶（39%）和鸡蛋（32%）相当。猪肝还具备生产功能性食品配料的潜力，如锌-原卟啉色素和味觉相关化合物（游离氨基酸和核苷酸）。尽管猪肝营养和技术潜力显著，但大量屠宰副产品仍被废弃或未充分利用，亟需可持续增值化策略。
酶法蛋白水解是将猪肝蛋白转化为生物活性肽的有前景策略。先前研究主要关注游离氨基酸和二肽、三肽，而中等大小肽段（7-25个氨基酸）对味觉和生物活性的贡献尚未被充分探索。加工条件（如超声预处理和顺序水解）可能显著影响肽谱生成，因此需要先进分析工具进行表征。肽组学结合计算机模拟工具可高效鉴定和预测功能肽，但评估超声预处理和顺序水解对肽组成影响的研究仍有限，且中等和大尺寸肽段对味觉的贡献尚未阐明。
**研究内容与结论**
本研究旨在评估不同加工条件下（包括超声预处理、单酶和顺序水解）猪肝水解物中7-25个氨基酸肽段的生物活性和味觉增强潜力。通过肽组学分析揭示酶选择是样品分化的主要因素，其次为水解时间和超声探头预处理。所有水解物组中预测鲜味肽比例高于苦味肽；PeptideRanker工具鉴定出92个新独特肽序列（生物活性得分>0.9），其中Protana Prime顺序水解物得分最高。预测的主要生物活性包括抗氧化、抗菌、抗糖尿病和抗高血压。模拟计算机模拟胃肠道消化后，47个肽在BIOPEP-UWM数据库中关联至18种生物活性，抗高血压和抗糖尿病活性尤为突出。
**意义**
本研究首次系统阐释了7-25个氨基酸肽段对猪肝水解物味觉和生物活性潜力的贡献，促进了猪肝副产品作为功能性食品配料的增值化应用，为开发清洁标签味觉增强剂和健康食品配料提供了新策略。论文发表在《EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法：
1. **肽组学分析**：通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在Tims TOF flex质谱仪上进行数据依赖性采集（ddaPASEF），以鉴定7-25个氨基酸的肽段，并使用FragPipe（MSFragger搜索引擎）进行蛋白鉴定和相对定量（基于MS1水平的LFQ强度）。样本队列来自新鲜猪肝（*Sus scrofa domesticus*，Duroc品种），由当地屠宰场提供。
2. **计算机模拟预测工具**：使用UMPred-FRL和BERT4Bitter预测肽的鲜味和苦味；PeptideRanker预测生物活性（得分>0.9为高活性）；AnOxPePred 1.0评估抗氧化和金属螯合潜力；StackDPPIV和Deepstack-ACE分别预测二肽基肽酶IV（DPPIV）和血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性；BIOPEP-UWM数据库模拟胃肠道消化（pepsin, trypsin, chymotrypsin）；MLCPP和DBAASP分别评估细胞渗透性和抗菌潜力。
3. **统计分析**：使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验比较水解度差异；主成分分析（PCA）、Pearson相关分析和热图基于肽信号强度进行样品聚类和分化评估。
**研究结果**
**Proximate composition and degree of hydrolysis**
猪肝成分分析显示：水分73.21±0.19 g/100 g，蛋白质21.12±0.26 g/100 g，脂肪4.79±0.33 g/100 g，灰分0.75±0.01 g/100 g，碳水化合物0.14±0.03 g/100 g，pH 6.77±0.13，水分活度0.994±0.001。水解度测定表明，Protana Prime顺序水解物（C2_4, C2_5, C2_6）水解度最高，其次为Flavourzyme顺序水解物（C2_1, C2_2, C2_3）。单酶水解物中，超声探头预处理显著提高了生肝Alcalase水解物和Flavourzyme水解物的水解度（P<0.05），使Flavourzyme水解物水解度与30 min Alcalase单酶水解物相当。超声预处理通过促进蛋白解折叠增加酶作用位点，从而提升水解效率。
**Peptidomic analysis**
PCA分析（图1A）显示，PC1（83.9%）和PC2（6.1%）共解释90%总变异。四组样品区分：非水解对照（LF1_1）、30 min Alcalase水解物（LF1_2）、120 min Alcalase水解物（LF1_3）和Flavourzyme水解物（LF1_4）。酶类型是主要分化因素，其次为水解时间，超声探头预处理仅在生肝Alcalase水解物中起显著分化作用。图1B中，顺序水解物（LF2_3和LF2_4）与单酶水解物（LF2_2）及非水解样品（LF2_1）分离，且超声预处理在Protana Prime顺序水解物中产生额外分化。Pearson相关分析（图2）显示，LF1_3/LF2_2、LF2_3、LF1_2和LF1_4组内正相关>0.5，而LF1_1/LF2_1和LF2_4组内无正相关，进一步证实酶类型的主导作用，且超声探头预处理在顺序水解物中具分化效应。热图（图3）显示，Flavourzyme顺序水解物信号强度最高，Protana Prime顺序水解物次之，单酶水解物和非水解样品最低。超声探头预处理增强了Flavourzyme和顺序水解物的肽释放强度，但未提高顺序水解物的水解度，表明其效应源于暴露额外酶切位点而非整体肽产量增加。
**In-silico assays**
**Evaluation of potential bioactivity and taste of the whole peptide content**
共鉴定45,312个肽段。PeptideRanker结果显示，11,306个肽（24.95%）得分>0.5，461个肽（1.07%）得分>0.9。按PCA分组，LF1_2肽数最多（23,931），但LF1_3高活性肽比例最高（27.94%得分>0.5；1.35%得分>0.9）。UMPred-FRL和BERT4Bitter预测显示，所有组中鲜味肽比例高于苦味肽。顺序水解物（LF2_3和LF2_4）肽数较单酶水解物（LF2_2）减少，但Protana Prime顺序水解物高活性肽比例最高（28.24%得分>0.5；1.90%得分>0.9）。鲜味/苦味比例在单酶和顺序水解物中保持稳定，表明顺序水解未增加苦味肽比例，结合先前游离氨基酸和二肽/三肽的味觉活性数据，整体水解物可能呈现愉悦味觉，可作为味觉增强剂。
**Evaluation of bioactive and food safety potential of peptides**
92个高活性肽（得分>0.9）来自52种蛋白，均未在先前文献中报道。AnOxPePred预测抗氧化得分为0.63-0.33，金属螯合得分为0.33-0.13。StackDPPIV和Deepstack-ACE预测显示，16个肽（17.39%）具DPPIV抑制潜力，43个肽（46.73%）具ACE抑制潜力。安全评估：30个肽（32.60%）具致敏性潜力，3个肽（3.26%）具潜在毒性。DBAASP预测9个肽（9.78%）具抗菌潜力（针对5种细菌）。MLCPP预测21个肽（22.82%）具细胞渗透性。味觉预测：63个肽（68.47%）为苦味，仅7个肽（7.60%）为鲜味。肽理化性质分析表明，疏水性、氨基酸组成（如Leu, Pro, His）与生物活性和苦味相关。
**Evaluation of bioavailability of bioactive peptides through gastrointestinal digestion**
模拟胃肠道消化后获得141个肽段，其中47个在BIOPEP-UWM数据库中具有已知生物活性，20个（42.55%）具致敏性，无毒性，26个（55.31%）可跨肠屏障。抗氧化和金属螯合得分与前一致。10个肽（21.27%）具ACE抑制潜力，所有47个肽具DPPIV抑制潜力。BIOPEP数据库显示18种活性，以ACE抑制（72.34%）和DPPIV抑制（69.70%）为主。其余94个肽（无已知活性）中，无毒性，40.42%具致敏性，59.57%得分>0.5。味觉预测：47个肽（33.33%）具鲜味潜力，79个肽（56.02%）为苦味；二肽VR被鉴定为盐味增强肽。与消化前相比，鲜味比例从7.60%升至33.33%，苦味比例从69%降至56.02%，表明小肽更易呈现鲜味。
**讨论与结论**
讨论部分指出，酶选择是影响肽生成的主要因素，顺序水解和超声预处理可促进具有抗氧化、ACE抑制和DPPIV抑制活性的肽生成。92个新肽序列的鉴定为功能性食品配料开发提供了候选。味觉方面，中等大小肽段呈鲜味优势，但部分肽段预测为苦味，整体味觉取决于鲜味与苦味化合物的平衡。结合先前研究中游离氨基酸、二肽/三肽的高含量及味觉活性值（TAV），顺序水解（Alcalase和Protana Prime）联合超声预处理是开发清洁标签味觉增强剂和功能性配料的有前景策略。但本研究局限性在于所有预测基于计算机模拟，缺乏实验验证，需通过感官、体外和体内试验确认。
**研究结论翻译**
本研究中，肽组学与计算机模拟方法的联合应用实现了对猪肝水解物中中等长度肽段（7-25个氨基酸）的表征，该肽段此前未被探索。这些分析显示，加工条件（如酶选择、顺序水解和超声预处理）影响肽组成及具有生物活性潜力肽段的生成。顺序水解，尤其是与超声预处理结合时，促进了具有预测抗氧化、ACE抑制、DPPIV抑制活性的肽段生成。此外，鉴定出92个具有PeptideRanker得分高于0.9的潜在生物活性肽，据研究人员所知，这些肽段此前未被报道。关于味觉相关特性，分析肽段显示预测鲜味潜力高于苦味潜力，尽管一些肽序列也被预测会贡献苦味。因此，这些水解物的感官特性可能源于鲜味与苦味化合物的平衡，而非完全积极的味觉属性。结合先前报道猪肝水解物中富含味觉活性游离氨基酸和二肽/三肽，这些结果表明，使用Alcalase和Protana Prime的顺序水解联合超声预处理，可能是从猪肝副产品开发清洁标签味觉增强剂和功能性食品配料的有前景策略。然而，本研究的一个重要局限性是，生物活性和味觉相关特性仅通过计算机模拟方法评估，未经实验验证。因此，预测的活性和感官特性应视为初步结果，需通过感官、体外和体内试验确认。尽管存在这些局限性，本研究为加工条件、肽生成、生物活性和味觉相关特性之间的关系提供了有价值的见解，有助于猪肝副产品的可持续增值化。
