综述：从细胞培养到动物寄生线虫的细胞生物学：生物技术进展

《Biotechnology Advances》：From cell culture to cellular biology in animal-parasitic nematodes: Biotechnological advances

　　

动物寄生线虫是具有重要医学与兽医学意义的病原体，然而其细胞生物学特征因复杂的生活史、宿主依赖性发育及特定发育阶段获取受限等因素而解析不足。本概念性综述系统梳理了线虫细胞生物技术从线虫来源细胞分离与维持，到细胞身份界定及其与生物学功能整合的演进历程。早期培养研究证实，来自自由生活与寄生线虫的细胞可被分离、维持并在部分条件下实现增殖，但其身份主要依赖形态学、生化活性及免疫学特征间接推断。单细胞（scRNA-seq）与单核转录组学（snRNA-seq）技术的出现从根本上改变了这一研究格局，以秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）为代表的模式生物为解析细胞多样性、发育轨迹及组织构型提供了基础方法与参考图谱。植物寄生线虫与寄生吸虫的研究进展亦为方法学优化提供了重要借鉴。在动物寄生线虫领域，上述技术已拓展至全虫解离、细胞核分离、组织特异性分析及空间转录组学等方向。类器官与共培养系统为解析宿主-寄生虫界面提供了实验平台，而功能遗传学平台则支持实验性扰动研究。当前研究格局呈现异质性：部分体系已构建细胞或空间图谱，另一些则通过培养体系、宿主来源模型或遗传操作具备更高的实验可操作性。目前尚无单一体系能同时实现全生命周期的细胞覆盖、空间分辨的组织构型解析、寄生虫来源细胞或组织的长期稳定培养及可靠的功能扰动。研究人员提出未来需重点将细胞身份与发育动态、解剖学背景、培养体系认证及可验证的实验功能相联结。上述进展正推动该领域从细胞维持与身份界定迈向细胞功能的理解与操控，从而为动物寄生线虫感染的防治提供新策略。

1. Introduction

动物寄生线虫是重要的医学与兽医学病原体，对人类与动物健康、动物福利及农业生产力构成显著负担。尽管其危害广泛，受复杂生活史、宿主依赖性发育、特定发育阶段获取困难及多数物种缺乏稳定细胞培养体系等因素限制，其细胞生物学机制仍知之甚少。传统研究多聚焦于整体生物、发育阶段及组织层面，虽提供了重要的寄生虫生物学认知，但难以解析组成细胞的身份、状态及功能，致使细胞身份界定、分化、组织构建、发育转换及宿主-寄生虫互作的细胞基础等核心问题长期悬而未决。线虫类群涵盖自由生活、植物寄生及动物寄生等多个谱系，生态位、生活史及实验可操作性差异显著，塑造了各异的研究问题与技术方案。本综述以兽医与医学相关的动物寄生线虫为核心，选择性纳入秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式参照，因其为细胞分离、原代培养、单细胞分析及细胞图谱构建提供了基础方法与概念框架；同时审慎纳入植物寄生线虫及寄生吸虫（尤其是Schistosoma spp.）的方法学进展，以提供比较视角。表1系统梳理了代表性线虫类群的细胞生物学资源现状，凸显了当前研究的进展与缺口。近二十年来，细胞培养、细胞分离及细胞分辨率技术的革新，显著拓展了线虫细胞生物学的研究边界。本综述作为概念性整合而非详尽目录，系统梳理了从早期细胞分离维持、单细胞技术与细胞图谱兴起，到上述方法在动物寄生线虫中应用的发展历程，呈现了从细胞培养、细胞身份直接界定到细胞身份与生物学功能整合的演进路径。

2. Cell culture and maintenance

2.1. Early nematode cell culture studies

线虫细胞水平的实验研究长期受限于细胞分离与体外维持的技术瓶颈。与多数脊椎及无脊椎动物模型不同，线虫具有坚韧的角质层与小体型，加之寄生线虫复杂的生活史依赖宿主环境，导致直接细胞实验难以开展，研究长期聚焦于整体生物、组织及发育阶段。早期研究的核心命题为线虫来源细胞能否在体外存活，受限于当时缺乏直接界定细胞身份的分子工具，研究者主要依赖形态学、活力、生化活性及免疫学特征评估培养细胞是否保留生物学功能。全虫培养研究曾证实Haemonchus contortus可在体外完成从感染期幼虫到成虫及产卵雌虫的发育，为后续寄生虫细胞体系建立提供了背景支撑。Coyne与Brake（2001）以感染期第三期幼虫（L3）为起始材料，在含酵母提取物及抗生素的IPL-41与SF900混合培养基中，于37°C、5.9% CO₂条件下成功维持寄生虫来源细胞群体超过48个月。该研究通过形态学、生化分析、蛋白表征及免疫学分析等多重验证，证实培养群体保留了氨肽酶-M样及磷酸水解酶活性，且免疫原性在绵羊免疫实验中得到验证。从历史视角看，该研究既体现了早期线虫细胞培养的进步，也暴露了时代局限：尽管通过多维度验证支持其生物学相关性，但缺乏直接界定细胞身份的分子工具，无法精确解析培养群体的细胞类型组成，这一挑战在转录组技术出现前是普遍存在的共性局限。

2.2. Primary culture systems for Caenorhabditis elegans

相较于寄生线虫，自由生活的秀丽隐杆线虫为细胞分离与培养方法的标准化提供了理想平台，许多后续应用于寄生线虫的技术（包括解离程序、原代培养条件及细胞操作）均在此体系完成优化。Christensen等（2002）建立了胚胎细胞原代培养体系，证实培养细胞可分化为具有功能的神经元与肌肉细胞，为离体研究单个线虫细胞提供了可重复框架。Strange等（2007）进一步发布了胚胎来源原代培养的详细操作方案，促进了方法的广泛应用；Zhang等（2011）则将体系拓展至幼虫阶段，证实后期发育阶段的细胞亦可被有效分离。植物寄生线虫的研究亦提供了重要借鉴，例如Manousis与Ellar（1990）成功建立了南方根结线虫（Meloidogyne incognita）成熟雌虫的二倍体连续细胞系，是少数已报道的寄生线虫连续细胞系之一，凸显了角质层破坏与持续增殖的长期技术挑战。近期植物寄生线虫的高分辨率胚胎转录组及根系取食位点的空间分析，进一步展示了空间技术在解析宿主-寄生虫互作中的价值，印证了细胞分辨率工具在线虫各谱系中的普适性。

2.3. The unresolved problem of cellular identity

尽管细胞分离与维持技术取得显著进展，早期研究仍无法直接界定培养线虫细胞的身份。形态学、生化及免疫学评估仅能证实细胞的存活、分化及生物学相关性，却无法解析培养群体的精确细胞类型组成。研究的核心挑战已从“维持线虫细胞”转向“系统鉴定细胞身份”，亟需细胞分辨率的分子技术突破。

3. Cell atlases and cellular identity

3.1. Moving to cellular resolution

2000年代末至2010年代初转录组技术的进步，首次使研究超越群体水平测量，实现细胞分辨率的基因表达解析。早期研究已能从单个胚胎细胞与卵裂球获取转录谱，奠定了线虫单细胞生物学的基础。随后高通量单细胞转录组技术的出现，实现了数千个单细胞的并行分析，加速了多物种细胞参考图谱的构建。秀丽隐杆线虫的应用具有里程碑意义：Cao等（2017）绘制了首个多细胞线虫的全面单细胞转录谱，在单细胞分辨率下系统解析了全虫的细胞多样性。Packer等（2019）进一步整合单细胞转录组数据与秀丽隐杆线虫独特的发育谱系，构建了谱系解析的分子图谱，将细胞身份与发育历史及分化过程直接关联。这些研究使细胞图谱超越了细胞类型目录的范畴，成为解析细胞组成、发育关系及组织构型的系统性参考框架，从根本上解决了早期方法的核心局限，奠定了现代线虫细胞生物学的概念与方法学基础。

3.2. Cellular specialisation and tissue atlases

在系统解析细胞身份的基础上，研究焦点转向特定组织与功能系统的细胞分辨率解析。Taylor等（2021）构建了秀丽隐杆线虫神经系统分子图谱，解析了神经元群体的转录多样性，揭示了神经元亚型的功能特化。Ghaddar等（2023）进一步将分析拓展至成体，构建了全虫基因表达图谱，提供了成体组织细胞多样性的全景视图。这些研究表明，细胞身份解析不仅适用于全虫水平，亦可深入特化组织与功能系统，研究目标已从“鉴定细胞类型”转向“理解细胞群体在组织内的组织、特化与协调方式”，细胞图谱由此成为探索细胞系统如何贡献于机体生物学的功能平台。

3.3. Extending cellular biology beyond model systems

尽管秀丽隐杆线虫确立了线虫细胞分辨率研究的方法学基础，但将这些技术迁移至寄生虫研究面临额外挑战：复杂生活史、宿主依赖性发育、特定阶段获取受限及细胞/细胞核分离困难，阻碍了方法学的直接转移。寄生吸虫的研究提供了重要先例：日本血吸虫（Schistosoma japonicum）的高分辨率单细胞转录组图谱解析了雌雄虫多个发育阶段的细胞群体，绘制了生殖与神经系统的谱系轨迹，揭示了雌雄配对相关的动态细胞变化，成功建立了从模式生物到寄生扁虫的方法学桥梁。至此，界定细胞身份的技术体系已趋成熟，但主要应用于自由生活线虫与少数寄生扁虫。下一阶段的挑战在于：能否将这些细胞分辨率方法成功应用于动物寄生线虫？这需要针对各寄生虫系统的生物学与技术限制对现有方法进行适应性改造。

4. Cellular biology of parasitic nematodes

4.1. From model systems to parasites

将细胞分辨率方法应用于动物寄生线虫面临显著的技术与生物学挑战。单细胞与单核技术虽革新了自由生活线虫研究，但其向寄生线虫的迁移并非易事。动物寄生线虫的复杂生活史、宿主依赖性发育阶段及特殊组织构型，显著增加了可行细胞与细胞核分离的难度；同时多数物种的实验可操作性远低于模式生物，限制了生物材料的获取与方法优化。因此，细胞解离方案、注释策略及分析框架均需针对各物种的生活史、组织构型及实验可及性进行定制化调整。第一代寄生线虫细胞图谱的诞生，既是生物学突破，也是方法学的重要成就，标志着该领域的关键转折：研究者已能直接在兽医与医学重要寄生虫中解析细胞身份，为在全新分辨率下研究发育、组织构型及宿主-寄生虫互作提供了可能。

4.2. Atlases of parasitic nematodes

首批研究虽在分类学覆盖与发育阶段上有限，但共同证实了在寄生线虫中解析细胞身份的可行性。马来布鲁线虫（Brugia malayi）的单细胞转录组学应用是重要突破：Henthorn等（2023）构建了微丝蚴的细胞图谱，通过转录谱鉴定了分泌产物的细胞来源及抗寄生虫药物应答的细胞群体，首次在医学重要寄生线虫中实现了细胞身份的直接解析。Korhonen等（2024b）采用单核转录组学分析了Haemonchus contortus胚胎，构建了该重要胃肠道寄生虫的首个细胞分辨率数据集，凸显了单核策略在克服组织解离困难中的实用价值。猪蛔虫（Ascaris suum）因体型大（可达35 cm）、组织丰富，成为优化细胞分离流程的理想模型：Tyagi等（2024）解析了其肠道细胞多样性，为组织特异性研究提供了范例。Pollo等（2024）构建了鼠类寄生线虫Heligmosomoides bakeri的初步单细胞图谱，恢复了配子、胚胎及雄虫肠道的稳健转录谱，通过与秀丽隐杆线虫直系同源标记的比较，揭示了保守特征与显著差异。Bharti等（2025）则绘制了钩虫Ancylostoma ceylanicum雌雄成虫的单细胞转录组图谱，系统注释了雌性10种、雄性13种转录上不同的细胞类型，揭示了性别特异性基因表达与细胞异质性。尽管如此，多数重要医学与兽医学线虫（如Trichinella spiralis、Strongyloides stercoralis、Ancylostoma duodenale及Necator americanus）仍缺乏全面的单细胞或单核图谱；Toxocara canis的主要进展集中于感染小鼠脑组织的空间转录组与单核RNA测序，以解析宿主-寄生虫界面。表1系统比较了代表性动物寄生线虫的细胞生物学资源现状，区分了直接寄生虫来源的细胞图谱与宿主组织的空间分析，明确了当前进展与核心缺口。这些研究共同表明，动物寄生线虫的细胞身份解析已在多物种、多发育阶段及多实验背景下实现，且方法学呈现多样性：单细胞转录组学适用于部分物种，而单核转录组学则成为克服组织解离障碍的重要替代方案，未来需持续优化细胞核分离与样品制备流程，以拓展图谱构建的物种与阶段覆盖范围。

4.3. From cellular identity to experimental tractability

第一代细胞图谱的建立仅是起点，下一阶段的核心挑战在于解析细胞群体在组织内的互作、对环境与宿主信号的应答，及其对寄生虫发育、存活与宿主互作的贡献，这需要整合超越转录组分析的新型实验与空间技术。空间转录组学具有变革性潜力：与需要解离组织的单细胞/单核技术不同，其保留了解剖学信息，可将细胞身份与组织构型、发育组织及潜在细胞间互作相关联。Airs等（2022）首次将空间转录组学应用于寄生线虫，在马来布鲁线虫中结合空间基因表达与解剖学信息，构建了首个组织尺度的分子图谱，定位了生殖、代谢及分泌相关组织的基因表达，证实了该技术在寄生线虫组织特异性生物学研究中的可行性。后续研究在寄生扁虫中进一步验证了空间技术的成熟度，如Fasciola hepatica的空间图谱解析了主要组织类型并定位了疫苗与药物靶点，日本血吸虫的整合分析揭示了生殖发育特征。自由生活线虫中也建立了全虫空间转录组框架，实现了近单细胞分辨率的基因表达解析并保留组织构型，为寄生线虫研究提供了方法学基准。空间技术亦开始革新宿主-寄生虫互作研究：以Toxocara canis感染为例，空间分析揭示了感染组织内寄生虫与宿主反应的时空组织特征，解析了局部免疫微环境与寄生虫诱导的组织重塑。植物寄生线虫的研究同样展示了空间技术在解析宿主-寄生虫界面中的价值，如拟南芥根系感染甜菜胞囊线虫（Heterodera schachtii）的空间转录组分析，揭示了线虫诱导取食结构的宿主转录响应空间分布。这些宿主中心的细胞与空间方法提供了宿主-寄生虫界面的互补视角，但不应直接等同于寄生虫自身的细胞图谱。类器官与共培养系统的发展为模拟宿主环境提供了新平台：Smith等（2021）建立了绵羊胃与肠道类器官，并实现了Teladorsagia circumcincta与类器官的共培养，证实感染期幼虫可侵入类器官腔并迁移通过上皮层；Duque-Correa等（2022）构建了盲肠样系统，模拟了Trichuris muris幼虫对宿主上皮的早期侵染；Hofer等（2025）开发的模式化胃肠道上皮单层，保留了上皮极性并允许顶侧与基底侧独立接触，进一步提升了类器官模型的可操作性，支持活体成像与感染分析。此外，功能遗传学平台提供了另一条实验路径：在Strongyloides stercoralis与Strongyloides ratti中，可实验操作的自由生活成虫支持性腺显微注射、CRISPR-Cas9介导的诱变及稳定转基因，尽管缺乏全面细胞图谱，仍可实现基因功能的直接研究。这些互补的实验路径——从寄生虫来源细胞、细胞核与组织的直接分析，到宿主中心的细胞与空间系统及功能遗传学平台——共同构成了当前寄生线虫细胞生物学的研究格局。

4.4. Emerging opportunities in parasitic nematode cellular biology

动物寄生线虫细胞身份的解析能力正从根本上改变可研究的生物学问题范畴。传统研究受限于整体生物、发育阶段或组织层面，而细胞分辨率方法使研究者得以从单个细胞群体的组织、状态及互作视角解析寄生虫生物学。首要机遇在于构建更精确的寄生虫发育解析框架：细胞图谱为鉴定发育轨迹、谱系关系及阶段特异性转录程序提供了基础，可解决传统批量方法难以回答的问题。其次，细胞分辨率方法将革新实验扰动的解析方式：未来研究可不再局限于异质性组织的平均应答，而是精确解析单个细胞群体对环境信号、发育转换、宿主因子及治疗干预的应答。多模态分析是重要发展方向：整合单细胞与空间转录组学已在寄生扁虫中展现出强大潜力，类似策略有望在动物寄生线虫中推广，将细胞身份与组织构型、发育轨迹及宿主互作直接关联。长期而言，最具意义的机遇在于建立实验可操作的寄生虫细胞体系：细胞图谱为评估培养细胞群体、分离细胞核及实验系统提供了参考框架，推动寄生虫细胞生物学从“维持细胞”迈向“操控细胞功能”。细胞身份正逐渐成为动物寄生线虫未来研究的核心组织原则。

5. Conclusions

过去二十年间，动物寄生线虫细胞研究经历了显著转型。早期研究聚焦于线虫来源细胞能否在体外分离与维持，虽奠定了实验基础，但受限于细胞身份界定方法的匮乏，培养群体主要依赖形态学、生化活性及免疫学特征进行间接表征。单细胞、单核及空间技术的出现从根本上改变了这一格局：单细胞与单核转录组学实现了细胞身份的直接测量，革新了对线虫发育、组织构型及功能生物学的认知。自由生活线虫的进展提供了细胞图谱的方法学基础，后续研究证实这些技术可成功迁移至动物寄生线虫，并需针对各物种、发育阶段及组织优化实验流程，涵盖全虫解离、细胞核分离、组织特异性分析及宿主中心的空间或类器官系统。当前技术格局呈现异质性：部分物种已拥有直接细胞或空间图谱，另一些则通过培养体系、类器官或功能遗传学平台具备更高实验可操作性。目前尚无单一体系能同时实现全生命周期的细胞覆盖、空间分辨的组织构型解析、寄生虫来源细胞或组织的长期稳定培养及可靠的功能扰动。未来进展需同时依赖不同寄生虫系统互补优势的挖掘，以及各能力在单一体系内的逐步整合。这些发展的意义远超细胞图谱本身：细胞身份为在全新分辨率下解析寄生虫发育、组织构型及生物学功能提供了框架，使传统方法难以触及的问题可在单个细胞群体水平得到解答。细胞图谱应被视为参考框架而非终点，其核心价值在于通过空间生物学、培养体系、类器官及遗传、化学或环境扰动，将细胞身份与解剖学背景、发育历史及可验证功能相联结。这种整合将阐明特定细胞群体如何参与发育、组织构建、宿主互作及致病过程，同时支持培养体系认证与干预靶点的严谨筛选。该领域正从线虫细胞维持、细胞身份直接界定，迈向细胞功能的实验研究与操控。实现这一整合将使细胞身份成为理解动物寄生线虫生物学及开发感染防控新策略的可操作框架。