《Biosensors and Bioelectronics》：Electrochemical logic sensing of protease activity patterns for stratifying breast cancer metastatic tendencies
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摘要乳腺癌的转移受器官特异性微环境的影响，但目前通过功能酶活性来判断转移倾向的血液检测方法仍较为有限。在此，我们开发了一种双通道电化学逻辑传感器，用于检测与不同转移状态相关的蛋白酶活性模式。该传感器界面是通过在金电极上使用两种PNA肽嵌合双链构建的。一种双链将组织蛋白酶B和组织蛋
摘要
乳腺癌的转移受器官特异性微环境的影响，但目前通过功能酶活性来判断转移倾向的血液检测方法仍较为有限。在此，我们开发了一种双通道电化学逻辑传感器，用于检测与不同转移状态相关的蛋白酶活性模式。该传感器界面是通过在金电极上使用两种PNA肽嵌合双链构建的。一种双链将组织蛋白酶B和组织蛋白酶K的响应片段与亚甲蓝输出信号相连，另一种双链则将组织蛋白酶B和组织蛋白酶S的响应片段与二茂铁输出信号相连。当匹配的蛋白酶组合出现时，会切割相应的双链，使带有氧化还原标记的片段从电极表面释放出来，从而产生不同的电流下降值以及电荷转移电阻的变化。逐步阻抗分析、荧光底物切割、差分脉冲伏安法以及干扰试验均验证了该逻辑界面的构建及其基于蛋白酶组合的响应特性。在临床样本分析中，ΔI_MB、ΔI_Fc和R_ct这三项电化学特征能够在非转移性、骨转移性、脑转移性和多部位转移性乳腺癌样本之间区分出不同的模式。通过随机森林模型整合这些特征后，可在训练集和独立验证集中得到有效的分类结果。这项工作展示了一种通过检测蛋白酶活性组合而非单一标志物来评估乳腺癌转移倾向的电化学方法，为功能性分层提供了实用方案。
引言
乳腺癌仍是全球女性中最常见的癌症类型，而转移扩散依然是导致疾病相关死亡的主要原因（Sung等人，2021；Giaquinto等人，2024）。远处转移的部位不仅会影响症状、治疗方案和随访策略，其重要性甚至不亚于转移本身的存在。骨转移常常会导致骨骼并发症，并影响疾病的长期控制，而脑转移则会带来神经系统风险以及与中枢神经系统相关的治疗障碍（Hofbauer等人，2021；Bailleux等人，2021；Wang等人，2021）。目前的评估方法主要依赖于影像学检查、病理学检测以及常规血清指标。液体活检虽提升了分子层面的监测能力，但大多数检测方法都是将循环肿瘤细胞、核酸、细胞外囊泡或可溶性蛋白质作为单独的标志物进行检测（Ignatiadis等人，2021；Ma等人，2024）。这些标志物固然有用，但却无法完全反映伴随肿瘤侵袭、基质重塑及器官选择性适应过程所发生的功能活性变化。
蛋白酶活性则能提供不同类型的信息。它并非仅反映分子的含量，而是能够记录肿瘤相关微环境中的活跃生化状态。组织蛋白酶家族的蛋白酶参与细胞外基质的降解、生长因子的释放、免疫调节以及组织侵袭过程。在本研究中，我们并未将单个组织蛋白酶视为独立的诊断标志物，而是利用它们共同的活性来构建传感逻辑。组织蛋白酶B因其与侵袭性蛋白水解作用相关，且其活性检测已在血清兼容的蛋白酶检测中展现出分析价值，因此被选为共同输入指标（Song等人，2021）。组织蛋白酶K则因与骨基质更新及乳腺癌引起的骨溶解作用有关，而被与组织蛋白酶B结合，形成与骨转移倾向相关的活性模式（Le Gall等人，2007；Zhang等人，2022）。组织蛋白酶S则因被认为与乳腺癌脑转移及肿瘤相关的蛋白水解网络有关，而被与组织蛋白酶B结合，形成与脑转移倾向相关的活性模式（Sevenich等人，2014）。这种设计旨在检测蛋白酶活性模式，而非将转移倾向归因于某一种特定的酶。
电化学生物传感技术非常适合用于这一目的，因为表面限制下的反应可以被转化为简洁、定量且可同时检测多种参数的读数形式（Jing等人，2022；Wu等人，2023）。当某种生物状态取决于多个分子输入信号时，逻辑门控探针尤其有用。现有的DNA逻辑系统已被用于分析相关的酶活性和疾病生物标志物，证明了多输入识别方式能够降低背景信号，提高结果的解读准确性（Zeng等人，2022；Xu等人，2022）。在此，我们使用了PNA肽嵌合探针构建了一种双通道电化学逻辑界面。由于PNA的中性主链能够实现稳定的碱基识别，同时有助于减少传感界面处的静电干扰，因此被用作杂交域。此外，PNA-肽嵌合结构还使得杂交域和蛋白酶响应片段能够整合到同一个连续的探针中（Moccia等人，2020；Li等人，2023；Xiao等人，2021）。可在同一探针结构中同时设置蛋白酶可切割的肽片段和氧化还原报告基因。我们在金电极上组装了两种双链：第一种包含组织蛋白酶B和组织蛋白酶K的响应片段，可产生亚甲蓝信号；第二种包含组织蛋白酶B和组织蛋白酶S的响应片段，可产生二茂铁信号。只有当存在匹配的蛋白酶组合时，才能有效去除电极表面的相应氧化还原标记片段，而电化学阻抗谱则可用于记录整体的界面变化情况。
利用这一平台，我们从每个临床样本中提取出了两种氧化还原逻辑输出信号ΔI_MB和ΔI_Fc，以及一种通过阻抗测量得到的辅助界面特征R_ct。这些特征首先被作为直接的电化学表型进行分析，随后再与随机森林分类器相结合。该模型被用作辅助工具，用于判断传感器是否获得了足够的信息以实现样本的分类。类似的特征整合策略在电化学生物传感领域越来越被广泛应用，包括双信号循环肿瘤细胞检测以及基于机器学习的电化学分析方法（Peng等人，2022；Tian等人，2024；Bocan等人，2025）。在训练集和验证集的分析中，被划分为非转移性、骨转移性、脑转移性和多部位转移性组的样本分别呈现出不同的电化学模式。这些结果支持使用PNA肽电化学逻辑传感策略来功能性检测蛋白酶活性组合，也为基于血液样本对乳腺癌转移倾向进行分层提供了可能的途径。
章节节选
材料与试剂
三(2-羧乙基)膦盐酸盐、6-巯基-1-己醇、氰化铁钾、氰化亚铁钾、氯化钾、磷酸盐缓冲液以及其他常用试剂均购自Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd. 组织蛋白酶B、组织蛋白酶K和组织蛋白酶S则购自上海泽业生物技术有限公司。PNA肽嵌合探针则由杭州肽生物技术有限公司合成并纯化。所有探针的序列及修饰信息详见表格。
工作原理
PNA肽电化学逻辑传感器的工作原理如图1所示。在金电极上组装了两种表面双链：双链A由可被组织蛋白酶B切割的锚定链和可被组织蛋白酶K切割的亚甲蓝报告链组成，而双链B则由可被组织蛋白酶B切割的锚定链和可被组织蛋白酶S切割的Fc报告链组成。PNA结构域负责维持电极上的双链结构，而肽结构域则提供蛋白酶响应位点。在不存在匹配的蛋白酶时
结论
在本研究中，我们开发了一种双通道PNA肽电化学逻辑传感器，用于分析与乳腺癌转移倾向相关的蛋白酶活性模式。通过将对应组织蛋白酶B、K和S的响应肽片段整合到表面限制型的PNA双链中，该传感器能够将CB+CK和CB+CS这两种活性模式转化为不同的亚甲蓝和Fc电流响应，同时R_ct可作为额外的界面特征。该传感器对匹配的蛋白酶表现出浓度依赖性的响应。
CRediT作者贡献说明
杨翔：写作——审阅与编辑、资金获取、概念构思。梁文：软件应用、方法设计、数据整理。焦瑾：写作——审阅与编辑、资源协调、资金获取、概念构思。刘兆军：验证实验、研究监督、软件应用、数据整理。王刚：写作——初稿撰写、方法设计、实验研究、正式分析、概念构思。
未引用参考文献
Li和Ma，2022；Wang等人，2023；Zheng等人，2020。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82371283、81672570）以及天然药物与仿生药物国家重点实验室（项目编号：K202009）的支持。
Gang Wang|Zhaojun Liu|Wen Liang|Jin Jiao|Yang Xiang
南京大学生命科学学院药物生物技术国家重点实验室，中国南京210023
