三叉神经电刺激通过调控谷氨酸转运体-1（GLT-1）介导的内质网应激减轻缺氧缺血性脑损伤

《Brain Research Bulletin》：Trigeminal Nerve Electrical Stimulation Attenuates Hypoxic-Ischemic Brain Injury by Regulating GLT-1-mediated Endoplasmic Reticulum Stress

　　

三叉神经电刺激（TNS）可减轻新生儿缺氧缺血性脑损伤。TNS可增强缺氧缺血损伤后海马区谷氨酸转运体-1（GLT-1）的表达。TNS可抑制PERK/ATF4/CHOP介导的内质网应激。GLT-1是TNS诱导的神经保护效应的关键介质。

**论文解读：三叉神经电刺激通过GLT-1介导的内质网应激调控减轻缺氧缺血性脑损伤**

**一、研究背景与问题提出**

缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy, HIBD）是围产期新生儿常见的神经系统疾病，主要由围产期窒息导致脑血流减少或中断引起，可造成不可逆的神经元损伤及长期后遗症，包括认知功能障碍和运动功能障碍。目前HIBD的治疗手段有限，亟需探索新的神经保护策略。

三叉神经电刺激（trigeminal nerve stimulation, TNS）是一种无创神经调控技术，通过刺激三叉神经分支（如眶上神经或上颌神经）激活脑干网状结构和皮层躯体感觉投射区，从而调节神经递质释放和脑血流灌注。已有研究表明TNS可改善大鼠脑缺血再灌注损伤模型的神经功能，但其潜在机制尚不明确。

谷氨酸转运体-1（glutamate transporter-1, GLT-1）是中枢神经系统中负责清除突触间隙谷氨酸的主要转运体，其下调可导致谷氨酸积聚并引发兴奋性毒性神经元损伤。内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）是细胞对缺氧、氧化应激等胞内稳态紊乱的重要适应性反应，但过度或持续的ERS激活可通过CHOP和caspase-12通路诱导神经元凋亡。

尽管GLT-1功能障碍和ERS均与缺氧缺血性脑损伤相关，但两者之间的机制联系尚不清楚。过量的细胞外谷氨酸可激活NMDA受体，导致细胞内钙超载，破坏内质网钙稳态并触发ERS信号通路。基于上述观察，研究人员假设TNS通过增强GLT-1表达、抑制ERS介导的神经元凋亡来发挥对缺氧缺血性脑损伤的保护作用。

**二、研究内容与主要技术方法**

本研究采用7日龄SPF级Sprague-Dawley大鼠乳鼠（15-17 g，雌雄各半，每组3雄3雌），购自SPF（北京）生物技术有限公司（许可证号：SCXK[北京]2019-0010）。动物随机分为5组（每组6只）：假手术组（Sham）、HIBD模型组、TNS干预组（HIBD+TNS）、TNS+GLT-1抑制剂组（HIBD+TNS+DHK，脑室内注射GLT-1特异性抑制剂二氢海人藻酸，10 μM）、TNS+PERK抑制剂组（HIBD+TNS+GSK，脑室内注射PERK特异性抑制剂GSK2606414，5 μM）。

主要技术方法包括：（1）采用改良Rice-Vannucci法建立新生儿缺氧缺血性脑病模型，即结扎左侧颈总动脉后置于8% O?/92% N?低氧舱中2小时；（2）TNS干预采用电针装置（Hwato SDZ-III）刺激右侧眶上神经分支皮肤投影区，参数为双相方波脉冲（10 Hz，0.2 ms脉宽，2 mA），每次30分钟，每6小时一次，共4次；（3）TTC染色评估脑梗死体积；（4）HE染色观察海马组织病理学变化；（5）Western blot检测GLT-1、GRP78、ATF4和CHOP蛋白表达；（6）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测GLT-1 mRNA表达水平。

**三、研究结果**

**3.1 TNS减轻HIBD模型大鼠的病理性脑损伤**

TTC染色显示，与Sham组相比，HIBD组脑梗死体积显著增加（P < 0.05）。TNS治疗显著减少梗死体积，而给予DHK和PERK抑制剂（GSK2606414）可部分消除TNS的神经保护作用。HE染色进一步证实，HIBD后海马出现严重的神经元变性、核固缩和细胞结构紊乱，TNS可显著减轻这些病理改变，而GLT-1抑制可部分逆转TNS的保护效应。上述结果表明TNS可减轻新生儿HIBD诱导的急性组织病理损伤。

**3.2 TNS恢复GLT-1 mRNA和蛋白表达水平**

RT-qPCR和Western blot结果显示，与Sham组相比，HIBD后海马GLT-1 mRNA和蛋白表达均显著降低（P < 0.05）。TNS治疗在转录和蛋白水平均显著恢复GLT-1表达，而DHK和GSK2606414给药可显著削弱这一效应。值得注意的是，由于PERK是ERS信号的主要上游调节因子，给予GSK2606414后海马GLT-1表达较HIBD+TNS组显著降低。这些发现表明TNS通过抑制PERK信号通路有效恢复海马GLT-1表达。

**3.3 TNS对内质网应激的影响**

Western blot分析GRP78、ATF4和CHOP表达显示，与Sham组相比，HIBD显著上调这三种ERS相关蛋白的表达（P < 0.05）。TNS治疗显著抑制GRP78、ATF4和CHOP的表达，而抑制GLT-1和PERK可大部分逆转TNS的抑制作用。这些结果表明TNS可有效抑制新生儿HIBD后ERS的过度激活。

**四、讨论与结论**

本研究首次系统证明三叉神经电刺激（TNS）通过调控谷氨酸转运体-1（GLT-1）介导的内质网应激（ERS）信号通路并抑制神经元凋亡，对缺氧缺血性脑病（HIBD）发挥神经保护作用。这些发现将GLT-1介导的ERS抑制确定为TNS诱导神经保护的关键机制。

研究结果显示，TNS显著降低HIBD模型大鼠的脑梗死体积并减轻组织病理学损伤，这与既往报道一致。TNS的神经保护作用可能归因于其激活三叉神经-脑干-皮层通路，促进脑血流、维持神经递质稳态。TNS可激活三叉神经感觉传入纤维，进而刺激蓝斑核，增加去甲肾上腺素等神经递质的释放。此外，TNS还可调节自主神经系统平衡、减轻缺血区域血管痉挛、进一步增强脑微循环。

本研究的主要发现是TNS显著上调HIBD大鼠海马区GLT-1表达，从而减轻谷氨酸积聚诱导的兴奋性毒性损伤。HIBD期间，缺氧引起的能量代谢衰竭显著抑制GLT-1表达和功能，进一步加剧谷氨酸介导的神经毒性。通过上调GLT-1表达，TNS加速谷氨酸清除、减少兴奋性毒性损伤，进而抑制ERS激活。然而，TNS调控GLT-1表达的具体分子机制仍有待阐明，特别是涉及NF-κB和CREB等转录因子以及DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传调控机制。

此外，TNS显著抑制ERS相关蛋白（包括GRP78、ATF4和CHOP）的表达，从而阻断ERS介导的凋亡通路。GRP78是ERS的关键调节因子，其上调代表ERS激活的早期标志。ATF4和CHOP是ERS的核心下游促凋亡介质，可促进促凋亡Bcl-2家族成员（如Bax）表达，同时抑制抗凋亡蛋白（如Bcl-2），最终导致caspase-3激活和细胞死亡。通过增强GLT-1表达，TNS减少谷氨酸积聚和钙超载，从而抑制ERS激活和神经元凋亡。

重要的是，使用GLT-1特异性抑制剂DHK进一步证实GLT-1是TNS诱导神经保护的关键介质。DHK逆转了TNS对HIBD大鼠神经功能、梗死体积和ERS相关蛋白表达的有益作用，表明TNS的神经保护作用很大程度上依赖于GLT-1上调。但GLT-1表达上调可被PERK抑制剂GSK2606414部分逆转，提示TNS的神经保护作用可能与ERS介导的GLT-1表达上调有关。然而，GLT-1表达的调控涉及转录、翻译和蛋白降解等多个层面，未来研究需阐明TNS如何特异性调控GLT-1表达。

研究人员选择海马作为研究区域，因为海马对缺氧缺血损伤特别敏感，且在HIBD相关认知缺陷中发挥关键作用。但皮层损伤同样存在，研究结果在皮层组织中可能有所不同，这是本研究的局限性。

与既往主要描述TNS神经保护作用的研究不同，本研究提供了机制证据，表明新生儿缺氧缺血性脑损伤后GLT-1介导的谷氨酸稳态恢复与ERS信号抑制密切相关。这一机制框架拓展了对TNS介导神经保护的理解，并确定GLT-1为新生儿HIBD的潜在治疗靶点。该研究发表在《Brain Research Bulletin》上，得到了陕西省自然科学基金面上项目（2024JC-YBMS-722）的资助。