磺胺甲噁唑通过PSMB6增加子痫前期风险：一项综合多组学与实验验证研究

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Sulfamethoxazole increases the risk of preeclampsia through PSMB6: A comprehensive multi-omics and experimental validation study

　　

**背景**：环境与饮食途径的磺胺甲噁唑（SMX）暴露已在孕妇群体中被检出，但其对子痫前期（PE）相关胎盘病理的影响——尤其是通过非治疗性慢性暴露途径——仍不清楚。**方法**：研究人员评估了母体SMX暴露对妊娠小鼠胎盘结构的影响，整合胎盘转录组数据与孟德尔随机化（MR）分析以识别候选靶点，利用分子对接、分子动力学模拟、细胞热转变分析（CETSA）和微量热泳动（MST）验证SMX与靶点的相互作用，并在滋养层细胞中进行功能缺失和SMX暴露实验以评估线粒体呼吸和氧化磷酸化（OXPHOS）。**结果**：母体SMX暴露破坏胎盘迷路，降低迷路/交界区面积比，扩大母体血窦。整合转录组和MR分析识别出9个候选靶点，其中PSMB6在PE胎盘中表达下调，并与PE风险降低存在遗传关联（MR OR=0.78）。分子对接和分子动力学模拟提示SMX-PSMB6结合稳定，CETSA和MST进一步支持该结合。单细胞和富集分析将PSMB6与滋养层细胞线粒体能量代谢和OXPHOS联系起来。功能上，PSMB6敲低损害线粒体呼吸并下调OXPHOS相关基因，而SMX暴露产生类似的线粒体功能障碍表型。**结论**：这些发现提示SMX暴露可能通过影响蛋白质稳态相关分子PSMB6并损害滋养层细胞线粒体能量代谢，导致PE样胎盘异常，为非治疗性SMX暴露的胎盘效应提供机制见解。

**论文解读：磺胺甲噁唑通过PSMB6增加子痫前期风险：一项综合多组学与实验验证研究**

**研究背景与问题**

磺胺类抗生素（如磺胺甲噁唑，SMX）在人类和动物医学中广泛使用，其环境残留因持久性和潜在毒性日益受到关注。SMX已在多种水体及食品中被检出，在上海市孕妇的生物监测研究中，59.1%的参与者尿液样本中检出SMX，中位浓度为21.5 μg/mg肌酐，提示妊娠期存在可测量的非治疗性暴露。妊娠期是胎盘发育和胎儿生长的敏感窗口，磺胺类药物可穿过胎盘，流行病学研究表明孕期母体磺胺暴露与包括子痫前期（PE）在内的多种胎盘介导不良妊娠结局相关。然而，现有研究多聚焦于临床或治疗性暴露，非治疗性SMX暴露是否影响胎盘结构及滋养层功能尚不清楚。PE是一种典型的胎盘介导妊娠疾病，影响约2%–8%的妊娠，其病理基础源于早期胎盘发育异常，包括滋养层功能障碍、螺旋动脉重铸不足、胎盘缺血等。蛋白质稳态（proteostasis）对胎盘功能至关重要，泛素-蛋白酶体系统（UPS）是维持蛋白质稳态的核心通路，而PSMB6作为20S蛋白酶体的重要β亚基参与维持蛋白酶体功能。此外，UPS还参与线粒体蛋白质质量控制，通过线粒体相关降解途径影响呼吸链复合体的组装与更新。线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）异常和氧化应激已被认为是PE相关胎盘病理的重要特征。因此，本研究旨在探究SMX暴露是否与PE样胎盘异常相关，并探索PSMB6是否可作为连接蛋白质稳态紊乱与滋养层线粒体功能障碍的潜在分子节点。

**研究内容与结论**

研究人员通过整合多组学、计算毒理学和实验验证的方法，系统评估了SMX暴露对胎盘结构和滋养层线粒体功能的影响。研究发现，母体SMX暴露导致妊娠小鼠胎盘迷路结构紊乱、迷路/交界区面积比降低、母体血窦扩大，并出现局灶性钙化沉积和纤维素样改变。通过整合胎盘转录组数据集GSE75010（包含80例PE患者和77例正常对照）与血浆蛋白孟德尔随机化（MR）分析（基于deCODE genetics的4907种血浆蛋白pQTL数据和FinnGen联盟R12版本的PE结局数据），经方向一致性过滤后识别出9个候选靶点，其中PSMB6在PE胎盘中表达下调，且与PE风险降低存在遗传关联（MR OR=0.78）。分子对接、分子动力学模拟、细胞热转变分析（CETSA）和微量热泳动（MST）实验进一步验证了SMX与PSMB6的直接结合。单细胞RNA-seq分析（GSE173193数据集，包含2例PE胎盘和2例正常对照胎盘，经质控后保留15,299个细胞）显示PSMB6在滋养层亚群中表达，尤其在外绒毛膜滋养层细胞（EVT）中变化显著，且与线粒体能量代谢和OXPHOS通路相关。功能实验表明，PSMB6敲低显著降低HTR-8/SVneo滋养层细胞的耗氧率（OCR），抑制基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力和ATP相关呼吸，并下调OXPHOS相关基因（COX15、NDUFS3、NDUFB10）的表达，同时减少ATP水平、增加ROS生成。类似地，SMX暴露（50 nM）也导致OCR下降和OXPHOS基因表达下调，与PSMB6敲低表型一致。该研究发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》。

**主要技术方法**

研究人员采用的关键技术方法包括：(1) 动物模型：C57BL/6妊娠小鼠自E8.5至E18.5经饮水给予500 μg/L SMX，收集E18.5胎盘进行组织学分析（H&E染色、免疫组化）；(2) 多组学整合：利用胎盘转录组数据集GSE75010（来自GEO数据库）进行差异表达分析，结合血浆蛋白pQTL数据（来自deCODE genetics）进行两样本孟德尔随机化分析，方向一致性过滤后筛选候选靶点；(3) 计算与实验验证：分子对接（AutoDock Vina）、分子动力学模拟（GROMACS，100 ns）、CETSA和MST（Monolith NT.Label-free系统）用于验证SMX与靶蛋白结合；(4) 单细胞分析：基于GSE173193数据集进行细胞聚类、亚群注释及体外敲除/过表达模拟（scTenifoldKnk/scTenifoldNet），结合共表达分析进行Hallmark基因集富集分析；(5) 功能实验：在HTR-8/SVneo滋养层细胞中通过siRNA敲低PSMB6或SMX处理，采用Seahorse细胞外通量分析、qRT-PCR、Western blot、ATP和ROS测定评估线粒体功能。

**研究结果**

**3.1 母体SMX暴露破坏胎盘结构**：H&E染色显示，SMX暴露组胎盘迷路相对面积减少，迷路/交界区面积比和迷路/总胎盘面积比显著降低，高倍镜下可见迷路局灶性结构紊乱、母体血窦不规则扩张、局灶性钙化沉积和纤维素样改变，定量分析显示母体血窦面积显著增加。

**3.2 筛选并识别PE核心靶点**：从GSE75010数据集中鉴定出1924个差异表达基因（|log?FC|>0.1，校正P<0.005），其中1078个下调、846个上调。MR分析从4907种血浆蛋白中识别出161个与PE潜在因果关联的蛋白（P<0.05）。通过交集及方向一致性过滤，最终获得9个候选靶点（8个保护性、1个风险性）。

**3.3 SMX与PSMB6结合的分子对接、分子动力学模拟及实验验证**：分子对接显示7个候选蛋白与SMX的结合能均低于-5.0 kcal/mol，其中PSMB6（-6.7 kcal/mol）与SMX形成氢键，涉及N端Thr1和Thr21残基。100 ns分子动力学模拟显示复合物在约10 ns后达到平衡（平均RMSD=0.29 nm），催化区波动低，自由能景观呈现单一深势阱。CETSA结果显示SMX使HTR-8/SVneo细胞内源性PSMB6的熔解温度提高5.6°C，MST实验证实SMX与重组PSMB6直接结合（表观KD=24.6 μM，95% CI: 12.0–52.5 μM）。

**3.4 SMX暴露抑制滋养层细胞和胎盘组织中PSMB6表达**：50 nM SMX处理24 h后，HTR-8/SVneo细胞中PSMB6 mRNA表达显著下降，蛋白质水平在0–36 h内逐渐降低。免疫组化显示SMX暴露组小鼠胎盘迷路层PSMB6阳性信号显著减弱，阳性面积定量减少。

**3.5 单细胞分析将PSMB6与滋养层线粒体通路关联**：单细胞UMAP聚类识别出10种胎盘细胞群，PSMB6在滋养层亚群中表达，尤其在PE胎盘的EVT中变化最显著。体外PSMB6敲除模拟、EVT共表达分析和体外过表达模拟的Hallmark GSEA均显示OXPHOS、脂肪酸代谢、MYC靶点、DNA修复等通路富集，提示PSMB6与EVT中线粒体OXPHOS功能网络相关。

**3.6 PSMB6敲低损害滋养层细胞线粒体OXPHOS**：PSMB6敲低后，Seahorse分析显示OCR曲线显著降低，基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力和ATP相关呼吸均显著下降。qRT-PCR显示OXPHOS基因（COX15、NDUFS3、NDUFB10）mRNA水平降低，同时ATP减少、ROS增加。

**3.7 SMX暴露损害滋养层细胞线粒体呼吸功能并下调OXPHOS基因表达**：50 nM SMX处理12 h后，OCR曲线下降，基础呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力和ATP相关呼吸均显著降低，COX15、NDUFS3、NDUFB10 mRNA表达下调，与PSMB6敲低表型一致。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究提出SMX暴露可能通过影响蛋白质稳态相关分子PSMB6并损害滋养层线粒体能量代谢，导致PE样胎盘异常。PSMB6作为20S蛋白酶体β亚基，参与细胞蛋白质稳态维持，其在PE胎盘中表达下调且MR分析显示保护性遗传关联，提示PSMB6可能有助于维持胎盘稳态。单细胞分析进一步将PSMB6与EVT中线粒体OXPHOS通路关联，这与滋养层细胞高能量需求（支持侵袭、迁移和螺旋动脉重铸）一致。与经典的叶酸拮抗机制不同，本研究提出SMX可能通过蛋白酶体相关蛋白质稳态通路影响胎盘细胞，PSMB6可作为候选机制节点。功能实验证实PSMB6敲低和SMX暴露均导致线粒体呼吸抑制和OXPHOS基因下调，支持SMX通过PSMB6相关通路损害滋养层能量代谢。体内胎盘结构异常（迷路紊乱、血窦扩张、纤维素样坏死和钙化）与PE相关胎盘发育异常特征相似。研究局限性包括：动物模型未评估母体血压、尿蛋白等全身性PE表型；未直接测量蛋白酶体活性；未进行体内条件性敲除或体外PSMB6过表达拯救实验；饮水暴露浓度（500 μg/L）高于环境水平，应视为机制探索性暴露；未纳入SMX代谢产物进行对接分析。

**结论翻译**：本研究提示，SMX暴露可能通过PSMB6相关通路导致PE样胎盘异常和滋养层线粒体OXPHOS损伤。整合转录组和MR分析识别PSMB6为与PE相关的潜在保护性靶点；分子对接、分子动力学模拟、CETSA和MST进一步支持SMX与PSMB6的直接结合。功能实验表明，PSMB6敲低和SMX暴露均损害滋养层细胞线粒体呼吸并下调OXPHOS相关基因表达。综上，本研究提出一个PSMB6相关的蛋白质稳态-线粒体功能轴，为SMX暴露与胎盘损伤之间的联系提供新的机制见解。未来需通过PSMB6拯救、蛋白酶体活性测定、母体PE表型评估或条件性敲除模型进一步验证该通路的因果作用和系统性相关性。