《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：A streamlined automated liquid handling and 96-well solid-phase extraction for single low-volume urine aliquot multiclass biomarker analysis in human biomonitoring
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实验室自动化在大规模生物监测研究中已获得显著重要性，在样品处理、前处理和净化流程中提供了显著优势。本研究介绍了一种经过验证的自动化96孔格式方法，用于同时提取和分析属于不同化学类别的多种尿液生物标志物。这些化学类别按字母顺序排列，包括属于大麻素、环境酚类、有机
实验室自动化在大规模生物监测研究中已获得显著重要性，在样品处理、前处理和净化流程中提供了显著优势。本研究介绍了一种经过验证的自动化96孔格式方法，用于同时提取和分析属于不同化学类别的多种尿液生物标志物。这些化学类别按字母顺序排列，包括属于大麻素、环境酚类、有机磷酸酯阻燃剂、非持久性农药、多环芳烃、烟草和挥发性有机化合物的化合物或其代谢物。自动化工作流程采用epMotion 5075 vtc工作站进行样品制备，具备自动化样品分装、酶预处理和固相萃取净化功能，随后进行液相色谱-串联质谱分析。方法验证使用加标0.1至10 ppb每种分析物的尿液质控池进行。结果表明精密度优异，各化学类别的天然和内标响应的变异系数均低于20%。加标样品的回收率一致地处于80%至120%范围内，证实了方法的准确性和可靠性。不同化学类别和浓度范围内的性能一致性凸显了该自动化方法的稳健性。该自动化系统有效定量了天然（未加标）尿液样品中低ng/mL浓度的生物标志物，显示出适用于全面暴露评估研究的灵敏度。
论文解读：自动化96孔固相萃取与液体处理系统用于尿液多类别生物标志物分析的方法学及其在人体生物监测中的应用
人体生物监测是评估人群环境化学物暴露水平的重要工具，尿液因其非侵入性采集特点成为最常用的暴露评估生物基质。随着现代环境暴露的复杂性日益增加，人群研究需要同时分析多种化学类别的化合物，包括持久性有机污染物、农药代谢物、邻苯二甲酸酯和酚类化合物等，这对分析方法的稳健性和多残留能力提出了更高要求。传统手动样品制备方法在大规模研究中存在显著局限，包括重现性不足、通量受限以及操作者依赖性变异，这些问题可能损害数据质量和研究结论。尽管实验室自动化在药物筛选和临床诊断领域已广泛应用数十年，但生物监测实验室在自动化采用方面相对滞后，主要原因是环境化学分析面临多残留方法需求、复杂基质效应以及不同化学类别间分析要求差异大等独特挑战。现有自动化方法往往局限于单一化学类别或特定目标分析物，且常需要较大样本体积或多轮类别特异性提取，难以满足全面暴露组学研究的需要。因此，开发一种能够从单管低体积尿液样本中同时提取和定量多种类别生物标志物的高通量自动化方法，成为推动大规模生物监测研究的关键技术需求。
本研究旨在建立并验证一种自动化96孔格式的样品处理与固相萃取方法，用于尿液中多种化学类别生物标志物的同时提取和分析。研究人员在既往已发表的多类别尿液分析方法基础上，聚焦于自动化流程的详细开发与验证。该自动化工作流程基于epMotion 5075 vtc液体处理工作站，涵盖自动样品分装、酶解去 conjugation、固相萃取净化，随后采用液相色谱-串联质谱分析。研究使用加标尿液质控池进行方法验证，评估精密度、准确度、回收率和灵敏度等关键性能指标。结果表明，该自动化方法在53种分析物中表现出优异性能，多数分析物的变异系数低于20%，回收率处于80%至120%范围，能够定量未加标尿液样本中低ng/mL浓度的生物标志物，为大规模人群暴露评估提供了可靠的技术支撑。
研究人员为开展本研究主要采用了以下关键技术方法：基于epMotion 5075 vtc工作站的自动化液体处理系统进行样品分装、试剂添加和固相萃取操作；96孔Oasis HLB固相萃取板进行样品净化和分析物富集；酶解预处理利用β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶进行结合态代谢物的去共轭；液相色谱-串联质谱分析采用双色谱柱系统（Thermo Betasil C18和Hypersil Gold AQ）结合三重四极杆质谱多反应监测模式进行多类别分析物检测。质控尿液池由匿名志愿者提供的尿液样本制备，经西奈山伊坎医学院机构审查委员会批准使用。
研究结果部分围绕以下几个关键方面展开：
色谱分离优化：研究人员通过比较两种不同液相色谱柱的分离效果，确定了环境酚类、多环芳烃和有机磷酸酯阻燃剂代谢物使用Betasil C18柱，非持久性农药、挥发性有机化合物代谢物、烟草生物标志物和大麻素代谢物使用Hypersil Gold AQ柱的双注射分析方法。优化后的色谱条件确保分析物与尿液基质内源性干扰物良好分离，获得满意的峰形和保留行为。
方法验证性能：在未加标尿液质控池中，50种分析物的浓度变异系数范围为0%至99%，其中12种分析物超过20%，8种低于定量限，4种在21%至29%之间。在1 ng/mL加标质控池中，变异系数范围为2%至28%，所有分析物均低于30%。回收率计算采用基线包含方法，以反映人源基质中内源性分析物的背景浓度，各化学类别的加标回收率介于72%至123%之间，多数分析物在80%至120%范围内。
化学类别代表性表现：环境酚类中双酚A回收率100%，变异系数5%；双酚S回收率98%，变异系数9%。多环芳烃代谢物中1-羟基芘回收率81%，变异系数6%；2-羟基芴回收率88%，变异系数8%。有机磷酸酯阻燃剂代谢物中磷酸二苯酯回收率91%，变异系数仅2%。农药代谢物中3-苯氧基苯甲酸回收率91%，变异系数3%。烟草代谢物中可替宁回收率97%，变异系数11%。部分分析物如FPBA、DBUP和若干多环芳烃代谢物在接近检测限浓度时表现出较高变异，这与其低浓度水平有关。
自动化流程的实践要点：研究人员提供了详细的自动化操作指南，包括防止样品间交叉污染的措施、SPE板活化和平衡的关键步骤、仪器维护和校准程序，以及针对不同液体类型的吸液参数优化。为应对尿液基质的高粘度和可变性，仪器液体类别设置为模拟甘油的高粘度流体参数，以补偿基质依赖的移液误差。
研究讨论部分指出，该自动化方法相较于传统手动方法具有显著优势，包括日处理量可达384份尿液样本、批次间重现性好、操作人员接触生物样本的风险降低、以及数字化可追溯性增强。同时，方法也存在若干局限性，包括仪器初始投资高、需要专业技术人员操作维护、对高粘度或含颗粒物样本的移液准确性可能受影响、以及不同化合物间交叉污染问题需要针对性优化洗涤程序。未来研究方向包括扩展分析物范围、完善全自动化集成、引入机器学习算法进行数据处理，以及推动跨实验室方法标准化。
研究结论表明，该自动化96孔格式方法成功实现了大规模生物监测研究中高通量、准确和精确的分析要求。方法在多种生物标志物和化学类别中展现出良好的精密度和准确度，变异系数通常低于20%，回收率处于80%至120%之间，使得以往因手动操作繁琐而难以实现的人群规模暴露评估成为可能。该方法能够同时高精度分析多种化学类别的生物标志物，有助于更全面地研究环境暴露，为监管机构制定暴露指南、识别新兴健康威胁和跟踪环境政策有效性提供关键数据。标准化的固相萃取过程和受控的样品处理确保不同实验室和时间段的结果一致性，支持长期趋势监测和多中心流行病学研究。这一经过验证的自动化方法满足了化学暴露日益增多时代对高效生物监测能力的迫切需求，为环境健康保护的循证决策提供支撑，并有助于实现对易感人群不良健康效应早期预警信号的全面监测。
