弥补水果过敏原检测的不足：一种用于检测食品中八种致敏水果的经验证的LC-MS/MS方法

《Food Chemistry》：Addressing fruit allergen detection gaps: A validated LC-MS/MS method for eight allergenic fruits in foods

　　•首个用于复杂食品基质中八种水果过敏原的多重LC-MS/MS检测方法。•SP3磁珠可解决以水果为原料的产品中蛋白质含量较低的难题。•该方法在果汁和酸奶中的检测灵敏度可达亚毫克/千克级别，回收率在68%至87%之间。

引言
食物过敏已成为全球性的重大公共卫生和食品安全问题，影响着全世界数亿人的健康，给医疗系统带来了沉重的经济负担（Muraro等人，2022；Sampath等人，2021）。在各类致敏性食品中，水果属于一种尤为复杂且常被忽视的类别，亟需科学界的重视（Fernandez-Rivas，2015）。随着水果种类和消费量的增加，以及花粉相关过敏症的日益普遍，水果过敏的发病率也在持续上升（Krikeerati等人，2023；Poncet等人，2020）。最近的流行病学研究表明，在中国、欧盟、英国、美国和日本，水果过敏约占所有食物过敏病例的1%至8%，某些地区的发病率甚至高于所谓的“八大”主要过敏原（Krikeerati等人，2023；Li等人，2022）。这一趋势凸显出对水果过敏原进行全面监测和管理策略的迫切需求。常见的致敏性水果包括芒果、荔枝、菠萝、猕猴桃、甜瓜，以及蔷薇科水果如苹果、桃子、樱桃和草莓（Costa等人，2023；Fernandez-Rivas，2015；Krikeerati等人，2023）。其临床表现通常由IgE介导，属于I型超敏反应，经历致敏期和激发期。在已致敏的人群中，过敏原与肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的IgE结合，会引发组胺及其他介质的释放，从而导致从轻微的口腔过敏综合征到严重甚至可能致命的过敏性休克等多种症状（Krikeerati等人，2023；Muluk等人，2018）。花粉-食物过敏综合征进一步加剧了水果过敏的复杂性，该综合征是由于花粉和新鲜水果中存在的交叉反应性过敏原因蛋白质结构相似而引发症状（Carlson等人，2019）。这类交叉反应通常涉及Bet v 1同源物（PR-10家族）、类 thaumatin蛋白（TLPs）、非特异性脂质转移蛋白（nsLTPs）、profilins以及几丁质酶（Carlson等人，2019；Poncet等人，2020）。值得注意的是，PR-10蛋白和profilins易受热和消化作用影响，通常只引起局部口腔过敏综合征，而nsLTPs和TLPs则更为稳定，常常导致全身性反应（Carlson等人，2019）。由于目前尚无治愈方法，严格避免接触过敏原仍是主要的处理手段，这也就凸显了准确检测和标注过敏原的重要性（VITAL 4.0，2024）。

水果衍生物在食品制造中的工业化加工和广泛应用，为过敏原风险评估和消费者保护带来了新的挑战。果汁、果泥、酱料和果丁等水果衍生物被广泛用于各种食品中，包括乳制品、饮料和糖果。在采集、储存、加工和包装过程中可能出现的交叉污染等供应链复杂问题，会导致意外过敏原的存在，从而对敏感人群构成威胁（VITAL 4.0，2024）。与大多数地区要求强制标注的主要过敏原不同，水果过敏原并未受到统一监管。例如，欧盟规定需标注14种过敏原，美国为9种，加拿大为11种，中国为8种，但这些清单中通常不包括水果过敏原，尽管某些地区已出台了部分规定（如中国台湾地区要求标注芒果，韩国要求标注桃子，日本则要求标注桃子、橙子、苹果和香蕉）（WHO & FAO，2022；Chang等人，2023）。这些监管漏洞可能会削弱消费者对预防性过敏原标注的信任，进而妨碍有效的风险管控。水果过敏原的风险评估包括危害识别、剂量-反应评估、暴露评估以及风险特征描述。通过双盲安慰剂对照食物激发试验来确定诱发剂量，如能引发5%过敏者反应的ED05剂量，对于建立风险管理中的参考阈值至关重要，它有助于进行定量危害分析并基于阈值进行标注（WHO & FAO，2023；Remington等人，2020；Zuberbier等人，2021）。商业产品中往往含有低于检测阈值的微量过敏原，因此需要具备低检测限、高定量精度以及高稳定性的检测方法（WHO & FAO，2023；Zuberbier等人，2021）。

目前用于检测食品过敏原的分析方法主要基于三种技术框架：基于抗体的酶联免疫吸附测定法（ELISA）、基于PCR的基因检测方法，以及基于蛋白质的LC-MS/MS分析技术（Graziano等人，2018；Tsai等人，2021；Yang等人，2024a）。ELISA具有较高的灵敏度和处理速度，但容易受到基质干扰、加工过程中的表位遮蔽（如热变性）以及交叉反应的影响，可能导致假阴性或假阳性结果（Sena-Torralba等人，2020；Tsai等人，2021）。PCR针对的是DNA，虽然DNA在食品加工过程中更为稳定，但该方法无法反映食品中过敏原蛋白的实际存在状态或浓度（Suh等人，2019；Holzhauser等人，2025）。质谱技术的最新进展使得LC-MS/MS成为用于定量分析食品过敏原的一种极为有用且应用广泛的技术（Shencheng等人，2025；Shih等人，2019；Yang等人，2025）。LC-MS/MS之所以表现更优，是因为它能够检测到即使在经过复杂加工后仍保持稳定的特定肽段生物标志物，而这些标志物与抗体所识别的构象表位不同（Yang等人，2024a）。此外，作为一种非免疫学技术，LC-MS/MS具有极高的特异性、灵敏度和准确性，因此特别适合用于检测那些传统免疫学方法难以处理的复杂加工食品中的过敏原（Cardona等人，2018；Sena-Torralba等人，2020）。不过，由于LC-MS/MS需要高昂的仪器和试剂成本、复杂的操作流程，且对操作人员的要求极高，需要其具备质谱操作和数据分析方面的专业技能，因此它更适合在实验室中进行精确定量，而非用于现场快速筛查。

近年来，针对水果过敏原检测的LC-MS/MS技术发展主要集中在靶向蛋白质组学方法上，包括特征肽选择、稳定同位素标记以及多反应监测技术，这些方法在加工后的食品基质中展现了更高的灵敏度和稳定性（New等人，2018；Rozanova等人，2021）。通过免疫磁性纳米粒子增强的UPLC-MS/MS技术，已经实现了对芒果Man i 1过敏原的高灵敏度检测，该技术将亲和富集与高分辨率检测相结合，从而在加工食品中也能达到极低的检测限（Tsai等人，2024）。鸟枪法蛋白质组学已被成功应用于定量检测桃子中的Pru p 1、Pru p 3和Pru p 7过敏原，其中稳定肽段的检测限在0.4–2000 fmol/μL之间，回收率则在90%至105%之间（Kang等人，2022）。在LC-MS/MS技术中运用稳定同位素二甲基标记技术，成功优化了猕猴桃Act d 1和Act d 5过敏原的检测方法，使其检测限低至8 pg/mL，数值十分出色（Shih等人，2019）。通过LC-MS/MS技术监测高压条件下的菠萝表位变化，研究人员也研究了加工过程对菠萝致敏性的影响（Liang等人，2015）；同时，通过对不同苹果基因型的过敏原特征分析，实现了对不同品种过敏风险的区分评估（Chebib等人，2022）。更广泛的蛋白质组学研究则利用LC-MS/MS技术分析了芒果中的过敏原成分，发现了其中含量较低的成分以及加工过程对过敏性的影响（Cardona等人，2018）。然而，目前仍存在一个重要的知识空白：现有研究大多针对单一水果或有限的过敏原组合，很少关注在果汁和酸奶这类成分复杂的食品基质中多种水果过敏原的同时定量检测。这一局限源于跨物种特异性肽段选择的困难、基质对提取效率的影响，以及多重反应监测技术的优化问题，这些因素都阻碍了对实际加工食品中多种过敏原共同存在的综合风险评估。因此，开发一种高效准确的多种水果过敏原同时定量检测方法，对于保障过敏人群的饮食安全以及帮助食品行业满足监管要求具有非常重要的现实意义。但目前现有的水果过敏原检测方法普遍存在检测范围狭窄、样品前处理流程复杂耗时，以及对蛋白质含量本来就较低的水果基质适应性差等问题，难以满足在复杂加工食品基质中同时定量检测多种水果过敏原的需求。

为弥补这一不足，本研究开发了一种多重LC-MS/MS检测方法，可用于定量检测果汁和酸奶中八种常见水果（猕猴桃、菠萝、芒果、香蕉、苹果、草莓、桃子和樱桃）的过敏原。在本研究中，采用了LC-HRMS技术系统地筛选和识别目标特征肽。此外，还创新性地引入了基于SP3磁珠的系统，用于水果蛋白质的富集、脱盐和肽段回收，从而克服了传统样品前处理方法的诸多局限性。这种整合了HRMS用于肽段发现、针对性预处理措施以减少基质干扰，以及MRM技术实现精准定量的方法，不仅能够更精确地监测意外过敏原的存在，还能为基于ED05的风险评估提供支持，进而有助于开发低过敏原含量的食品。该方法的意义在于，在过敏症日益普遍的背景下提升全球食品安全水平，为监管标准的统一提供依据，推动过敏原免疫疗法的标准化发展，最终填补分析技术上的缺口，让加工食品更加安全。

部分内容节选
化学品与试剂
碳酸氢铵（NH?HCO?，纯度≥99%）、尿素（纯度≥99%）、Tris-HCl（纯度≥99%）、二硫苏糖醇（DTT，纯度≥99%）、碘乙酰胺（IAA，纯度≥99%）以及三氟乙酸（纯度≥99%）均购自德国达姆施塔特的Merck公司。测序级修饰胰蛋白酶则来自美国威斯康星州麦迪逊市的Promega Corporation公司。乙醇、乙腈和甲酸（HPLC级）购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市的Thermo Fisher Scientific公司。分析级丙酮则由中国医药化学试剂有限公司提供。

整体实验策略与方法
为应对水果过敏原检测所面临的分析难题，本研究提出了一种经济高效、高通量的LC-MS/MS检测方法，可用于定量分析八种常见水果中的微量过敏原，这八种水果分别是猕猴桃、菠萝、芒果、香蕉、苹果、草莓、桃子和樱桃。我们的方法采用了靶向蛋白质组学技术，借鉴了诸如用于桃子过敏原定量分析的鸟枪法蛋白质组学技术以及绝对定量策略等最新研究成果。

结论
本研究成功开发并验证了一种全面的LC-MS/MS检测方法，可同时定量检测复杂食品基质中八种常见水果的过敏原。该研究采用系统化的方法，结合LC-HRMS技术进行肽段发现、针对不同基质优化样品前处理流程，以及利用MRM技术进行定量分析，有效解决了水果过敏原检测中的关键分析难题。与传统的免疫学检测方法相比，所开发的该方法表现出更优异的分析性能。

CRediT作者贡献说明
沈成颖南：撰写——初稿、可视化、项目管理、方法学、研究实施、正式分析、数据整理。周美珍：方法学、研究实施。赵玉萌：研究实施、数据整理。李思毅：研究实施。徐宇桐：验证、研究实施。高雅楠：撰写——审阅与编辑、监督。贾晓雪：撰写——审阅与编辑。高敏：软件操作、项目管理。张荣：验证。刘书燕：撰写——审阅与编辑。

资金来源
本研究得到了农业科技创新工程（ASTIP）、国家自然科学基金（项目编号32372444）、新疆重点研发计划（2022B02026-4），以及中国农业科学院创新工程基础研究中心（CAAS-BRC-FNH-2025-03）的资助。

未引用参考文献
Chang等人，2022

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

沈成颖南|周美珍|赵玉萌|李思毅|徐宇桐|高雅楠|贾晓雪|高敏|张荣|刘书燕|叶峰|张雅|夏双梅|李毅|杨树鹏