《Food Bioscience》：Ancestral reconstruction of fungal laccases enables broad-spectrum detoxification of co-occurring mycotoxins: Product identification, cytotoxicity assessment, and wheat matrix application
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摘要谷物中多种结构各异的霉菌毒素同时存在，会带来严重且复杂的健康风险。本研究通过祖先序列重构技术，获得了一种源自真菌漆酶的酶，该酶具有更广的底物范围，能够在无需催化剂的情况下转化多种霉菌毒素。经过筛选，LacANC258被认定为极具潜力的漆酶，其对黄曲霉毒素B1的转化效率可达98
摘要
谷物中多种结构各异的霉菌毒素同时存在，会带来严重且复杂的健康风险。本研究通过祖先序列重构技术，获得了一种源自真菌漆酶的酶，该酶具有更广的底物范围，能够在无需催化剂的情况下转化多种霉菌毒素。经过筛选，LacANC258被认定为极具潜力的漆酶，其对黄曲霉毒素B1的转化效率可达98.1%，对玉米赤霉烯酮的转化效率为99.2%，而对于漆酶通常难以作用的赭曲霉毒素A和T-2毒素，其转化效率也分别达到29.6%和29.3%。此外，这种酶的稳定性也很高，在50℃条件下半衰期可达36小时。通过UPLC-MS/MS分析可以确定这四种霉菌毒素的转化产物，细胞毒性试验则表明酶处理后这些毒素的毒性有所降低。分子对接和福井函数分析有助于了解该酶的底物结合机制以及与其广谱底物特性相关的易氧化位点。在实际应用方面，LacANC258在小麦粉体系中的霉菌毒素转化效率高于现有的其他漆酶。综上，LacANC258有望成为一种无需催化剂的有效酶制剂，用于解决谷物类食品中多种霉菌毒素同时存在的污染问题。
引言
食品和饲料常常会同时受到多种霉菌毒素的污染，这要么是因为某些真菌能够产生多种霉菌毒素，要么是因为多种产毒真菌共存。这类混合污染带来的健康风险可能比单一霉菌毒素的危害更大，包括肝毒性、基因毒性、免疫抑制、肾毒性、致畸性以及致癌性（Raj等人，2022；Tian等人，2022；Zhao等人，2021；Sun等人，2023；Yang等人，2020）。黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和T-2毒素因其高毒性及高发率而尤为值得关注（Alshannaq等人，2017），这就凸显出需要能够同时针对多种霉菌毒素的解毒方法。
目前已有多种物理、化学和生物方法被用于霉菌毒素的解毒处理（Shanakhat等人，2018）。其中，酶法解毒因其毒性较低、反应条件温和、不会造成二次污染且能保留食品的营养价值，相比传统方法具有明显优势，是提升食品和饲料安全性的有力手段（Xu等人，2022）。然而，由于霉菌毒素往往同时存在，因此需要具备广谱底物范围的酶才能有效应对。
漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜的氧化酶，能够转化多种化合物，包括酚类化合物、芳香胺类以及杂环化合物（Janusz等人，2020）。正是由于这种催化多样性，漆酶被视为霉菌毒素解毒的理想生物催化剂。不过，目前关于漆酶用于霉菌毒素解毒的研究大多集中在黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮上，因为这两种毒素的结构适合漆酶催化的反应（Gao等人，2024；Qin等人，2021；Sun等人，2024）。而赭曲霉毒素A和T-2毒素由于不含酚基或芳香胺基团，属于漆酶的罕见底物。事实上，已有研究显示，漆酶对这两种毒素的转化效率普遍低于对前两种毒素的效率。例如，Ery4漆酶能够完全转化玉米赤霉烯酮，但却无法转化赭曲霉毒素A和T-2毒素（Loi等人，2018）。同样，来自Weizmannia coagulans 36D1的Lac-W漆酶虽然能将黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的转化率分别提高到88%和60%，但对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A、T-2毒素以及FB1的转化率仅分别为34%、12%、19%和18%（Hao等人，2023）。尽管氧化还原催化剂能够拓宽漆酶的底物范围并提高难氧化化合物的转化效率，但它们的成本以及潜在的安全问题可能限制其在食品和饲料领域的应用（Gu等人，2021；Park等人，2021）。因此，那些能够直接转化这类特殊底物的漆酶显得尤为重要。更重要的是，目前对于漆酶处理后产生的赭曲霉毒素A和T-2毒素转化产物的研究还相当有限，这也制约了对其酶法解毒效果进行全面评估。
作为一项新兴技术，祖先序列重构为开发具有更强催化性能和更广底物范围的酶提供了有效途径（Zeng等人，2024；Jian等人，2024；Chen等人，2022）。最近有研究显示，经过重构的祖先漆酶在降解黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮方面的效率，要高于现有的相应酶株（Liu等人，2025）。由此可见，祖先漆酶有望成为拓展漆酶底物范围的优质候选者，尤其是能够帮助漆酶处理像赭曲霉毒素A和T-2毒素这样的特殊底物。
Trametes hirsuta AH28-2菌株含有六种漆酶同工酶，即LacA-F（Xiao等人，2006；Liu等人，2026），这些酶曾被视为霉菌毒素解毒的潜在候选者。初步检测结果显示，这些漆酶对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮具有较强的转化能力，但对脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和T-2毒素的转化能力较弱。本研究旨在通过祖先序列重构技术培育出具有更广底物范围的漆酶，从而实现无需催化剂即可同时降解多种霉菌毒素的目标。在所有经过重构的祖先漆酶中，通过分子对接和活性测试，LacANC258被认定为最具潜力的人选，它不仅对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的转化效率更高，其底物范围也更为广泛，甚至包括赭曲霉毒素A和T-2毒素。研究人员还通过UPLC-HRMS/MS技术鉴定出了这四种霉菌毒素的转化产物，同时进行了细胞毒性试验，并用受污染的小麦粉进行了实际解毒实验，以此验证该祖先漆酶的解毒潜力与实用价值。此外，还通过分子对接和基于DFT的福井函数分析，进一步研究了该酶的底物结合机制以及参与转化过程的易氧化位点，从而为LacANC258具备广谱底物特性提供了理论依据。
章节节选
材料
包括ABTS（2,2′-偶氮双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)）和愈创木酚在内的各类化学试剂均购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯市）。纯度的黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和T-2毒素则从Pribolab公司（中国青岛）购买，并储存在-20℃环境中。DMEM培养基、10%胎牛血清以及青霉素-链霉素-两性霉素B也购自BioInd公司（中国上海）；细胞计数试剂盒-8则来自Dojindo公司（中国上海）。Pichia
筛选用于霉菌毒素解毒的 AH28-2菌株中的漆酶
以小麦为原料制成的食品往往同时含有黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和T-2毒素（Lee等人，2017）。因此，在初始筛选阶段就纳入了这五种毒素，以便在模拟食品实际污染的场景下，全面评估 AH28-2菌株所产生的漆酶的底物范围。由于漆酶主要倾向于氧化酚类化合物、芳香胺类以及其它富电子结构的物质，此前关于漆酶用于霉菌毒素解毒的研究大多聚焦于
结论
总而言之，通过祖先序列重构技术，我们成功开发出了LacANC258这种具有广谱功能的酶制剂，可有效用于解决谷物类食品中多种霉菌毒素同时存在的污染问题。在无需催化剂的情况下，LacANC258对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的转化效率分别可达98.1%和99.2%，同时还能够转化赭曲霉毒素A和T-2毒素，这两种毒素原本并非漆酶的常见作用底物，但其转化效率也分别达到了29.6%和29.3%。通过UPLC-HRMS/MS技术，我们明确了这四种霉菌毒素的转化产物
CRediT作者贡献说明
刘帅峰：实验研究、数据整理。郑韵雅：结果验证、实验研究。刘静静：结果验证、实验研究。刘胜龙：方法设计、实验研究、数据整理。冯岩：初稿撰写、方法设计、实验研究、数据整理。肖亚忠：文章润色、研究指导、资源提供、项目管理、概念构思。张学成：文章润色、研究指导、项目管理、概念构思。刘娜：资源协调。周宇：
利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关联。
致谢
本研究得到了以下机构的资金支持：联合资助来自中国国家自然科学基金委员会（编号：U22A20442）；中国国家自然科学基金委员会（编号：32370133、32470122）；以及安徽省教育厅的重点研究计划项目（项目编号：2024AH050065）。
冯岩|刘胜龙|刘静静|郑韵雅|刘帅峰|张银良|方伟|周宇|刘娜|张学成|肖亚忠
安徽大学生命科学与医学工程学院，中国安徽合肥230601
