《International Dairy Journal》：From Phenotype to Early Warning: Risk-Oriented Differentiation of “Rapid Proliferation” vs. “Biofilm Residue”
Pseudomonas Risk in Cold-Chain Milk Using an ERA Assay
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摘要本研究分析了低温链牛奶中主要腐败菌属假单胞菌的腐败表型，并开发了一种酶重组扩增检测方法。在522株嗜冷微生物分离株中，假单胞菌占绝大多数（93.3%），其中69.9%属于脆弱假单胞菌亚群，21.6%属于荧光假单胞菌其他谱系。表型检测显示不同特征：脆弱假单胞菌参考菌株在4℃下能
摘要
本研究分析了低温链牛奶中主要腐败菌属假单胞菌的腐败表型，并开发了一种酶重组扩增检测方法。在522株嗜冷微生物分离株中，假单胞菌占绝大多数（93.3%），其中69.9%属于脆弱假单胞菌亚群，21.6%属于荧光假单胞菌其他谱系。表型检测显示不同特征：脆弱假单胞菌参考菌株在4℃下能快速在液体环境中增殖，而荧光假单胞菌参考菌株则在不锈钢表面形成更强的生物膜，表明其更易在表面存活。我们开发了一种柠檬酸钠辅助的酶重组扩增检测法。柠檬酸钠预处理可减轻牛奶基质对检测的抑制作用，无需富集即可实现检测，基于≥95%阳性标准，脆弱假单胞菌的检测限为102 CFU/mL，荧光假单胞菌为103 CFU/mL。通过31份市售乳制品样本的验证，该检测法具有初步应用价值。这种检测方法是一种快速、针对特定物种的检测工具，可用于有针对性地筛查假单胞菌。
引言
冷藏乳制品因其新鲜的营养成分和低温储存条件，已成为乳品市场中的重要品类。然而，其富含营养的基质以及持续处于低温环境，使得其在整个生产链中——包括原料采集、低温储存运输、加工灌装以及零售分发环节——极易被嗜冷腐败微生物污染并大量繁殖（Enayaty-Ahangar等人，2021）。这类污染会导致产品质量严重下降，保质期大幅缩短（Wang等人，2025）。在嗜冷微生物中，假单胞菌属被公认为是冷藏牛奶中主要的腐败相关细菌（Liang等人，2025），这主要是因为它们具有很强的低温适应能力、能够分泌热稳定的胞外酶（Almeida等人，2026），以及较强的生物膜形成能力（Muthuraman等人，2025）。这些特性使得它们成为导致冷藏乳制品风味变差、凝结、产气以及过早腐败的主要因素。尽管乳品行业已广泛采用严格的卫生措施，但由假单胞菌引起的腐败问题依然频发，这说明目前的微生物控制策略存在明显缺陷（Muthuraman等人，2025）。与短暂的外源污染不同，假单胞菌污染往往涉及多种途径，包括通过原料引入、在低温储存过程中繁殖、在设备表面持续存活，以及加工过程中的交叉污染。这类污染通常具有情境依赖性且难以根除，仅靠常规的卫生清洁和热处理无法彻底解决，因此成为提升冷藏乳制品质量稳定性和安全控制水平的重要技术障碍。
目前，对于冷藏牛奶中假单胞菌的研究和监测主要集中在总嗜冷菌计数以及属水平筛查上（美国公共卫生服务局/食品药品监督管理局，2023；Quintieri等人，2021）。然而，这种“标准化”的监测方法忽略了细菌群落的多样性，存在一个重要缺陷：它只能确认存在污染，却无法区分风险是源于低温储存运输过程中的快速繁殖，还是源于生物膜脱落以及加工设备表面的交叉污染（Reichler等人，2021；Reichler等人，2018）。现有的传统方法无法通过单一的细菌计数指标来区分这两种污染途径。因此，乳品企业往往采取缺乏差异化的通用应对措施，这些措施成本高昂、效率低下，也不利于精准控制。尤其是，细菌种类、表型特征、污染途径与风险类型之间的关联尚未得到系统研究，这成为了实现冷藏牛奶中腐败细菌的精准早期预警和有针对性预防的关键障碍。
近期研究表明，假单胞菌属并非一个同质的生态群体，不同物种可能采用不同的环境适应策略。有些菌株偏好利用可溶性营养物质，在冷藏条件下快速繁殖，从而加速牛奶中的腐败进程（Javidi等人，2025；ávila等人，2025）。而另一些菌株则倾向于产生胞外聚合物，具备更强的表面黏附能力和生物膜形成能力，因此更易在设备表面存活，造成反复的交叉污染（Maifreni等人，2023；Briega等人，2025）。因此，明确主要腐败相关物种的表型差异，是准确区分污染途径的前提。此外，复杂的牛奶基质会对核酸扩增产生强烈抑制作用，若不进行预富集，则难以快速检测出高风险假单胞菌，这也是将基于表型的风险模型转化为实际检测工具的主要技术障碍（Zhang等人，2019；Herman等人，1995）。
在此背景下，本研究构建了一个闭环框架，用于对冷藏牛奶中主要的假单胞菌污染模式的表型特征分析、快速检测及风险区分。首先，通过从冷藏牛奶样本中分离并进行分类鉴定，确定了主要的腐败相关目标菌株。其次，由于在第一阶段检测到它们的出现频率较高，因此选择脆弱假单胞菌和荧光假单胞菌作为代表性物种。每种物种各选取一株参考菌株，另外再选取三株脆弱假单胞菌亚群分离株和三株荧光假单胞菌亚群分离株作为验证菌株，用于比较它们的生长动力学、在不锈钢表面的定植情况以及生物膜形成能力。通过比较，明确了这两种菌株作为指示菌的潜力，分别可用于指示液体牛奶阶段的快速繁殖风险和设备表面上的持续存活风险。第三，为克服牛奶基质带来的抑制作用，本研究采用了柠檬酸钠解离预处理方法，并结合酶重组扩增技术，开发出一种无需预富集的直接检测方法。最后，使用市售样本评估了根据物种水平分型结果检测潜在污染模式的可行性。本研究为冷藏牛奶中腐败相关假单胞菌的早期预警、风险识别以及有针对性的后续控制提供了科学依据和实用的技术方法。整个实验设计，包括样本收集、嗜冷菌分离、代表性物种选择、表型特征分析、酶重组扩增检测方法的开发以及风险识别，详见图1。
章节要点
样本与菌株
本研究共收集了15份牛奶样本，包括原牛乳、原山羊乳以及市售冷藏牛奶。原牛乳和原山羊乳样本分别来自内蒙古和陕西的养殖场。9份市售冷藏牛奶样本为新鲜牛乳和新鲜山羊乳，通过电子商务平台购买。这些样本的详细信息包括产品类型、加工状态、来源或品牌类别、储存和运输信息等。
分离得到的嗜冷微生物组成及主要假单胞菌目标菌的分布
通过低温培养分离法，从15份原奶和冷藏奶样本中共分离得到522株嗜冷微生物。分类鉴定结果显示，在属水平上，假单胞菌属占绝对优势，共有487株，占总数的93.3%，其余属的菌株共35株，占比6.7%（见图2A）。这些结果表明，在所检测的冷藏牛奶中，假单胞菌是主要的嗜冷腐败相关细菌群体。
讨论
作为一种在持续低温条件下保存的富含营养的食品基质，冷藏牛奶面临着强烈的选择压力，这使得那些代谢效率高、耐寒性强的嗜冷细菌更容易在其中大量繁殖（Yuan等人，2019）。在本研究中，从冷藏牛奶中分离得到的可培养嗜冷微生物中，假单胞菌占绝对多数，共有487株，占522株的93.3%，这一结果与以往关于腐败相关微生物的研究结果一致。
结论
通过从冷藏牛奶中分离并鉴定可培养的嗜冷细菌，本研究表明假单胞菌属是冷藏乳制品中占绝对优势的嗜冷腐败相关细菌群体，其中脆弱假单胞菌组和荧光假单胞菌组被选为用于开发针对性检测方法的代表性目标群体。本研究进一步明确了这些主要腐败相关菌株的差异化表型特征。
CRediT作者贡献说明
杨艳歌：写作——审稿与编辑，写作——初稿撰写，可视化，方法学，研究实施，数据整理，概念构建。蔡杰：验证，研究实施，数据整理。刘彤：验证，方法学，研究实施。苗雅倩：写作——初稿撰写，方法学，研究实施。胡新波：写作——初稿撰写，方法学，研究实施，数据整理。康杰：写作——初稿撰写，研究实施，数据整理。申图旭：写作——审稿与编辑。
未引用参考文献
Janda和Abbott，2007；刘等人，2025；Sang和Oh，2025；田等人，2021。
数据可用性
基于16S rRNA和gyrB序列分析得到的菌株级BLAST信息及分类结果见补充表S8。样本元数据、分离得到的菌株数量以及主要的分类群信息见补充表S1。重复检测水平的酶重组扩增检测结果，包括检测限阳性数据、市售样本验证结果以及检测效率数据，见正文及补充表。原始的16S rRNA和gyrB序列文件、原始的酶重组扩增检测荧光数据等也一并提供。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFF1100900）以及陕西省市场监督管理局科技计划的支持（2023KY06）。
施文轩|杨艳歌|蔡杰|刘彤|苗雅倩|胡新波|康杰|申图旭|徐秀丽
