新型牦牛奶肽的筛选、表征及其钙结合特性

《International Dairy Journal》：Screening, Characterization and Calcium-Binding Properties of Novel Yak Milk Peptides

　　

• •
  通过FACS结合胰蛋白酶的方法筛选出了新的钙结合肽。
• •
  从牦牛奶蛋白中鉴定出了12种具有强效钙结合能力的肽。
• •
  WHPs和CHPs通过羧基/氨基与Ca²⁺结合，从而提升Caco-2细胞中对钙的吸收。
• •
  源自牦牛奶的肽复合物主要通过TRPV6通道转运Ca²⁺。

引言

钙是人体内含量最丰富的矿物质。大约99%的钙以羟基磷灰石晶体的形式存在于骨骼和牙齿中，为身体提供结构支撑，而剩余1%的钙则存在于血液和软组织中，负责调节肌肉收缩、神经传导以及血液凝固等重要的生理过程（Bers, 2002; Matikainen et al., 2021; Weaver, 2006）。然而，钙缺乏是一个普遍存在的公共卫生问题（Shlisky et al., 2022），它会增加患骨质疏松症、佝偻病以及心血管疾病的风险（Chung et al., 2016）。尽管有各种钙补充剂可用，但由于生物利用度低、溶解性差以及可能引发的肠胃不适如胀气等问题，其治疗效果往往有限（Shkembi et al., 2021）。

为克服这些缺陷，研究方向逐渐转向从食物中提取的钙结合肽。这类肽能与钙形成可溶性复合物，相比无机或有机钙盐，能显著提升钙的生物利用度和吸收率。虽然大米、海洋胶原蛋白等来源也已被研究过（J. Gao et al., 2024; W. Yang et al., 2024），但乳制品蛋白——尤其是骆驼奶和牦牛奶这类特殊乳汁中的蛋白——因其独特的氨基酸组成和生物活性，被视为极具潜力的候选材料。

在各类乳制品蛋白中，牦牛奶展现出了非凡的潜力。牦牛奶产自帕米尔高原等原始的高海拔地区，属于天然绿色食品。更重要的是，与传统牛乳相比，牦牛奶具有更优越的营养价值。我们的初步研究表明，牦牛奶的蛋白质含量较高（约4.30%），脂肪含量也较高（约4.63%），同时还含有免疫球蛋白以及多种必需氨基酸（约48%）和矿物质（Mamet et al., 2022; P. Wang et al., 2025）。此外，牦牛奶还有助于改善与骨质疏松相关的骨骼健康。除了提供必要的矿物质外，其有益作用还部分源于对肠道钙吸收和肾脏钙重吸收的促进作用，而其含有的生物活性蛋白和肽类也可能协同作用于骨骼代谢（Mamet et al., 2025; J. Zhang et al., 2023）。鉴于牦牛奶高蛋白质含量、丰富的钙元素以及已观察到的促进钙吸收的作用，牦牛奶蛋白有望成为制备钙螯合生物活性肽的良好原料。

乳蛋白是钙结合肽的重要前体。酪蛋白磷酸肽是迄今为止研究最为广泛的乳源钙结合肽，其核心序列为Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu，这类肽能与钙离子形成可溶性复合物，保持肠道内矿物质的溶解状态，从而促进钙的吸收（Schlimme et al., 1995; Sun et al., 2016）。此外，乳清蛋白水解物也能产生具有钙结合活性的肽，比如Glu-Gly和Phe-Asp，而这些肽的钙螯合能力主要来源于谷氨酸和天冬氨酸残基上的羧基（Sun et al., 2016）。

尽管人们对牛乳中的钙结合肽已有较多了解，但牦牛奶中所含同类肽的识别机制及吸收机制目前仍不明确。同时，牦牛奶富含蛋白质且氨基酸组成独特，这意味着其水解物中可能含有具有优异钙结合特性的新肽类；不过这一研究领域目前仍处于起步阶段。

我们之前的研究已经证实，全脂牦牛奶能够促进肠道对Ca²⁺的吸收以及肾脏对Ca²⁺的重吸收，进而提高钙的生物利用度，有助于缓解骨质疏松症（Li et al., 2022; J. Zhang et al., 2023）。尽管牦牛奶在促进钙保留方面已被证明有效，但仍有两个关键问题阻碍着新一代钙补充剂的开发：一是难以从复杂的水解物中精确分离出特定的生物活性肽序列，二是目前还不清楚这些肽是如何促进细胞内钙运输的。为解决这些问题，本研究提出了一种将荧光激活细胞分选技术与酶解法相结合的新策略。与传统方法不同，FACS技术能够在细胞层面高精度地筛选并获取那些具有较强钙吸收能力的肽。因此，我们的目标是从牦牛奶蛋白（乳清蛋白和酪蛋白）的水解物中分离并鉴定出新的钙结合肽。之后，我们将利用Caco-2细胞模型以及TRPV6特异性抑制剂来严格验证这些肽的作用机制，以确认TRPV6离子通道在其中所起的作用。这项研究不仅能够阐明牦牛奶肽的钙结合机制，还能为高效钙补充剂的研发提供坚实的理论基础。

章节要点

材料与试剂

牦牛奶采集自中国新疆的帕米尔高原。胎牛血清购自北京生物制品有限公司；最小必需培养基购自上海吉博公司；青霉素-链霉素、胰蛋白酶和EDTA购自上海海克朗公司；Fluo-3/AM购自北京库拉伯公司。钙检测（微孔板法）和碱性磷酸酶检测试剂盒则分别来自南京建城生物工程研究所和上海碧云天生物技术公司。

钙结合肽的筛选与纯化

水解程度会直接影响肽的分子量分布及其功能特性。如图1A所示，碱性蛋白酶在酪蛋白和水解物中的水解程度最高，分别为52.55%和37.33%，而胰蛋白酶的水解程度则相对较低，分别为35.51%和25.34%。随后，我们利用FACS技术检测了这些水解物在Caco-2细胞中的钙吸收能力。如图1B所示，虽然所有蛋白酶水解物都显著提升了

结论

在本研究中，我们通过结合荧光激活细胞分选技术和胰蛋白酶水解法，从牦牛奶的乳清蛋白和酪蛋白中筛选出了具有高钙结合活性的新肽。其中，7种源自乳清蛋白的肽序列以及5种源自酪蛋白的肽序列都表现出极高的钙亲和力。随后我们制备的乳清蛋白

作者贡献说明

赵波：论文撰写——初稿撰写、可视化处理、数据整理。 李欣怡：可视化处理、方法设计。 郭燕平：效果验证、资源获取、方法设计、数据分析。 李文婷：可视化处理、软件应用、数据整理。 Torkun. Mamet：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、数据整理、概念构思。 Nidhi Bansal：论文撰写——审阅与编辑、效果验证、研究指导。

未引用参考文献

Albrecht and Stortz, 2005; Angelis and Turco, 2011; Liu et al., 2025; Schlimme and Meisel, 1995; Shkembi and Huppertz, 2021; Weaver and Heaney, 2006; Zhao et al., 2014.

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本项研究得到了新疆人才发展基金的资助（项目编号：XJRC-2025-KJ-PY-KJLJ-126）。作者声明不存在利益冲突。同时，我们也要衷心感谢中国国家留学基金委员会（CSC）对本研究国际合作的支持。

赵波|李欣怡|郭燕平|李文婷|Torkun. Mamet|Nidhi Bansal