《International Immunopharmacology》：miR-221-3p–mediated CPT2 suppression links cardiomyocyte metabolic stress to NET-associated inflammation in myocardial ischemia–reperfusion injury: Multi-omics evidence and experimental validation
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摘要背景脂肪酸氧化功能受损以及中性粒细胞胞外陷阱形成增加都会导致心肌缺血再灌注损伤。目前尚不清楚心肌细胞代谢功能障碍是否会导致中性粒细胞活化。方法我们以缺血性心脏病为结局，对1400种血浆代谢物进行了双样本孟德尔随机化分析，随后通过基于汇总数据的随机化分析确定候选基因。此外还分析
摘要
背景
脂肪酸氧化功能受损以及中性粒细胞胞外陷阱形成增加都会导致心肌缺血再灌注损伤。目前尚不清楚心肌细胞代谢功能障碍是否会导致中性粒细胞活化。
方法
我们以缺血性心脏病为结局，对1400种血浆代谢物进行了双样本孟德尔随机化分析，随后通过基于汇总数据的随机化分析确定候选基因。此外还分析了五个小鼠心肌缺血再灌注微阵列数据集以及一个已发表的心脏单细胞RNA测序数据集，以识别相关细胞类型并预测细胞间信号传导机制。通过双荧光素酶报告基因实验检测了miR-221-3p与Cpt2 3′非翻译区之间的直接结合情况。随后利用miR-221-3p反义分子、AAV9-shCpt2和DNase I在体内验证这一通路。还对假手术组、心肌缺血再灌注组以及接受抗miR-221-3p处理的小鼠进行了无目标心肌代谢组学分析。
结果
经过错误发现率校正后，随机化分析共识别出18种与缺血性心脏病相关的代谢物。其中神经酰肉碱（C24:1）是唯一具有风险倾向的酰基肉碱，其比值比为1.065，P值仅为0.030；而十八烷二酰肉碱则表现出最强的保护作用，比值比为0.924，P值极低，为2.13×10?6。以C24:1作为暴露因素的汇总数据随机化分析将CPT2确定为候选基因，其b_SMR值为-0.52。在五个心肌缺血再灌注微阵列数据集中，Cpt2同时出现在脂肪酸氧化功能下降的相关基因集合和NET生成相关基因集合中，二者相关性曲线下面积为0.869。此外，Cpt2与Ncf4和Cyba的数值呈负相关，相关系数分别为-0.83和-0.80。单细胞分析显示，再灌注后第一天心肌细胞中的Cpt2表达水平下降。不同动物模型中，心肌细胞的脂肪酸氧化功能评分与中性粒细胞NET生成评分呈负相关，相关系数为-0.49，P值为0.036。CellChat分析表明，Cpt2表达较低的心肌细胞会向髓系细胞释放更多的损伤相关分子模式物质及趋化因子。miRWalk和TargetScan预测中，只有Mmu-miR-221-3p这种miRNA在心肌缺血再灌注模型中表达上升，且能够作用于Cpt2，这一相互作用也通过报告基因实验得到了验证。在体内实验中，提前使用miR-221-3p反义分子处理可恢复CPT2的表达水平，减少活性氧及NET相关标志物的产生，降低心肌梗死面积，同时改善急性心脏功能。而AAV9-shCpt2处理则几乎可以逆转上述所有效应。在心肌缺血再灌注模型中，C24:1的浓度升高了68.9倍，而经过反义分子处理后则下降了11.4倍，该差异的P值仅为9.2×10?4。
结论
随机化分析及基于汇总数据的随机化分析将C24:1和CPT2列为关键候选因素，后续的转录组学、单细胞分析、体内实验以及代谢组学研究进一步证实，miR-221-3p介导的CPT2表达抑制与急性心肌缺血再灌注损伤期间心肌细胞脂肪酸氧化功能下降及NET相关炎症反应之间存在关联。在这一预处理模型中，抑制miR-221-3p的表达能够恢复CPT2的功能，减轻心脏损伤及NET相关改变，同时降低心肌中C24:1的浓度。
引言
缺血性心脏病是全球范围内主要的死亡原因之一[1]、[2]。再灌注虽然有助于挽救心肌组织，但也可能引发额外的组织损伤[3]、[4]。即便进行了成功的血管重建手术，仍有一些患者会出现不良的心室重构和心力衰竭症状[5]。深入理解加重再灌注损伤的机制，有助于寻找新的心脏保护策略。
成年心脏约50%至70%的ATP来源于线粒体内的脂肪酸β-氧化过程[6]。肉碱棕榈酰转移酶系统负责调控长链脂肪酸进入线粒体基质[7]。缺血再灌注会破坏这一代谢途径，导致脂肪酸氧化不完全、脂质中间产物积累以及线粒体功能异常[8]、[9]。冠状动脉疾病患者的血液中，长链和超长链酰基肉碱的水平会升高，这类物质包括C16、C18、C22、C24和C24:1[10]、[11]。目前尚不确定这些变化是增加了缺血性心脏病的发病风险，还是仅仅反映了疾病的严重程度。目前已有大量关于缺血性心脏病的遗传学数据，但针对实验性心肌缺血再灌注模型的相关数据较为缺乏。因此我们选择缺血性心脏病作为随机化分析的结局指标，筛选出潜在的代谢物，以便在后续的心肌缺血再灌注模型中进行进一步研究。
先天免疫系统的激活也是导致再灌注损伤的重要因素之一。中性粒细胞会早期聚集在缺血的心脏区域[12]，它们能够释放中性粒细胞胞外陷阱，这类陷阱由解聚的染色质、组蛋白以及抗菌蛋白组成[13]、[14]。在无菌性炎症状态下，过量的NET生成会加剧内皮功能紊乱、微血管阻塞以及心肌细胞损伤[15]、[16]。在临床前心肌缺血再灌注模型中，抑制或降解NET能够减轻损伤[16]、[17]，不过再灌注后促使NET生成的局部信号机制至今仍未完全明确。
代谢物能够调控免疫细胞的功能。琥珀酸和衣康酸可以改变巨噬细胞的反应特性[18]、[19]，而脂质类物质则会影响中性粒细胞的行为[20]、[21]。目前还不清楚心肌细胞脂肪酸氧化功能受损是否会导致心肌缺血再灌注模型中的中性粒细胞活化。CPT2是一种位于线粒体内膜上的酶，它能够将长链酰基肉碱转化为用于β-氧化的酰基辅酶A。CPT2活性降低会导致长链酰基肉碱在细胞内积累，进而引发线粒体应激反应[7]、[22]，这些变化可能会加剧炎症反应。微小RNA也能够调控心脏的代谢功能和应激反应，但目前尚未发现有微小RNA能够将脂肪酸氧化酶的表达与心肌缺血再灌注模型中的NET相关炎症联系起来。
首先，我们以缺血性心脏病为结局指标，开展了全范围的代谢组学随机化分析，并通过基于汇总数据的随机化分析确定与特定代谢物相关的基因。随后，我们分析了小鼠心肌缺血再灌注模型中的整体转录组数据和单细胞转录组数据，以识别相关的细胞类型以及免疫细胞之间的信号传导路径。我们通过计算机方法筛选出了潜在的上游微小RNA，并通过双荧光素酶报告基因实验检测了这些微小RNA与Cpt2 3′非翻译区之间的直接结合关系。最后，我们利用miR-221-3p反义分子、AAV9-shCpt2和DNase I在体内验证了这一信号通路，同时通过无目标心肌代谢组学分析评估了相关的代谢变化。图1总结了整个研究的设计方案。
章节节选
孟德尔随机化分析
我们采用双样本孟德尔随机化分析方法，研究遗传学预测的血液中代谢物水平对缺血性心脏病发病风险的影响。这些代谢物数据来自加拿大老龄化纵向研究项目，该研究共检测了8299名参与者的1091种代谢物以及309种代谢物比值。缺血性心脏病的统计数据则来源于FinnGen第11版数据库，该数据库包含了75,592例病例和378,141例对照组成员的数据[24]。这两个数据集的参与者大多为欧洲血统。对于每一种代谢物，那些符合特定遗传变异条件的
随机化分析及基于汇总数据的随机化分析确定C24:1和CPT2为与缺血性心脏病风险相关的候选因素
在完成工具变量选择后，共有346种代谢物暴露因素拥有足够的工具变量（见图2A）。间接加权法分析共识别出54种具有统计学意义的关联关系，其P值低于0.05。经过Benjamini–Hochberg错误发现率校正后，仍有18种代谢物保持显著意义，其中4种与缺血性心脏病发病风险正相关，14种则具有保护作用（见图2B和D，以及补充表S6）。在这18种代谢物中，没有一种存在异质性、方向性多效性或反向因果关系的迹象，这一结论是通过Cochran's Q检验以及孟德尔随机化Egger截距分析得出的。
讨论
本研究旨在探讨miR-221-3p介导的CPT2表达抑制是否与心肌缺血再灌注模型中心肌细胞脂肪酸氧化功能下降及NET相关炎症反应之间存在关联。人类遗传学分析结果、公共转录组数据、报告基因实验、小鼠干预实验以及心肌代谢组学分析的结果都支持这一关联存在。
随机化分析结果显示，C24:1是唯一一种在错误发现率校正后仍具有显著风险倾向的酰基肉碱，与缺血性心脏病发病风险正相关。C22和C24也显示出相同方向的统计学关联。C24:1是一种
结论
本研究明确了miR-221-3p/CPT2通路在急性心肌缺血再灌注损伤过程中，心肌细胞脂肪酸氧化功能受损与NET相关炎症反应之间的关联作用。随机化分析表明，遗传学预测的血液中C24:1水平越高，缺血性心脏病的发病风险越大；基于汇总数据的随机化分析则将CPT2确定为候选基因。在小鼠心肌缺血再灌注模型中，提前使用miR-221-3p反义分子处理可恢复CPT2的表达水平，减少NET相关标志物的产生，同时改善急性心脏功能。而AAV9-shCpt2处理则几乎可以逆转上述所有效应。在心肌缺血再灌注模型中，被标记为C24:1的代谢物浓度会出现升高现象
作者贡献
Malike Mutailipu和A.M.负责这项研究的构思与设计工作。Malike Mutailipu负责数据分析并撰写论文初稿。A.A.和A.M.参与了数据分析及结果解读工作。D.M.和A.M.对论文进行了细致的修改。A.M.负责整个研究的监督工作并筹集研究资金。S.M.、Maiwurulila Maiwulanjiang和D.P.则协助进行数据解读及论文修改工作。所有作者均参与了最终稿件的审核与确认。
CRediT作者贡献说明
Malike Mutailipu：负责论文的初始草稿撰写、可视化分析、方法设计、正式数据分析、数据整理以及研究概念的构建工作。Abudousaimi Aini：负责论文的审阅与编辑工作、可视化分析、结果验证、相关研究探索以及数据整理工作。Duolikun Mutailifu：负责论文的审阅与编辑工作、可视化分析、结果验证以及方法设计工作。Subi Maimaitirexiti：负责论文的审阅与编辑工作、结果验证以及相关研究探索工作。Maiwurulila Maiwulanjiang：负责论文的审阅与编辑工作以及可视化分析工作。Diliyaer Paerhati：负责论文的审阅与
伦理审批
所有动物实验均严格遵循相关机构的规定，且已经获得了新龙优舒生命科技有限公司（杭州）动物实验伦理委员会的批准，审批编号为NLYS-m202506001。
资助情况
本项研究得到了天山高层次医疗卫生人才培养计划的资助，项目编号为TSYC202301B004。
利益冲突声明
所有作者均声明，自己不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
我们感谢新龙优舒生命科技有限公司（杭州）为我们提供实验平台支持以及在小鼠实验方面的帮助。同时，我们也感谢那些为本研究提供数据支持的研究人员以及各类数据库的贡献者，这些数据来源包括GEO数据库和FinnGen数据库。
Malike Mutailipu|Abudousaimi Aini|Duolikun Mutailifu|Subi Maimaitirexiti|Maiwurulila Maiwulanjiang|Diliyaer Paerhati|Abudunaibi Maimaitiaili
中国新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市新市区李玉山路137号，新疆医科大学第一附属医院心脏外科
