柔性多模态神经探针，集成三电极适配体传感，用于体内多巴胺动力学和神经活动监测

《ACS Chemical Neuroscience》：Flexible Multimodal Neural Probe with Integrated Three-Electrode Aptameric Sensing for In Vivo Monitoring of Dopamine Dynamics and Neural Activity

　　

神经功能源于电活动与神经化学信号之间的相互作用，然而大多数植入式神经接口主要记录电生理信号，缺乏用于神经递质监测的分子特异性。在此，研究人员开发了一种柔性多模态神经探针，将片上三电极电化学适配体传感器与电生理记录位点集成，用于联合监测细胞外多巴胺（DA）动力学和神经元活动。通过控制金纳米结构（AuNS）从0.50 V到0.70 V的电沉积，系统优化了电化学界面的制备。在0.65 V下的电沉积在增加电化学活性表面积（ECSA）、表面形貌、制备重现性和电隔离之间取得了最佳平衡，实现了约4.7倍的ECSA增强，探针间变异系数（CV%）为2.02%。将亚甲基蓝标记的DA适配体组装到AuNS工作电极上，用于序列特异性分子识别，而集成的Ag/AgCl参比电极和纳米结构铂对电极完成了片上传感系统。电化学阻抗分析进一步证明了逐步功能化后重现性的界面特性。电生理电极在1 kHz下表现出平均阻抗为366.02 ± 18.63 kΩ，探针间CV%为5.09%。方波伏安法（SWV）频率从10到200 Hz进行了实验优化，100 Hz在分析响应、背景电流和重现性之间提供了最佳平衡。在优化条件下，传感器表现出序列特异性DA识别、对电活性干扰物的选择性，以及实验确定的10 fM检测限。确定了两个绝对线性响应区域：0.5–10 pM（R² = 0.9945）和0.5–10 nM（R² = 0.9949），而更宽的可检测浓度范围从10 fM延伸到1 μM。流动注射和脑仿体实验证明了可逆的DA传感。在急性大鼠尾壳核实验中，静脉注射诺米芬辛诱导了DA相关的电化学响应，伴随神经元放电和γ/高γ局部场电位活动增加，支持该平台用于急性多模态神经化学和电生理体内研究。

**论文解读：柔性多模态神经探针用于体内多巴胺动力学与神经活动监测**

**研究背景与问题**

神经信息处理依赖于电信号与化学信号在局部脑微环境中的协调交互。电生理记录可提供高时间分辨率的神经元放电和局部场电位（LFP）信息，但缺乏对神经递质化学信号的分子特异性。而神经递质介导的化学信号传递着突触效能、神经调质状态和状态依赖的回路调节等互补信息。电化学耦合的失调与多种神经及精神疾病相关，因此亟需开发能够同时探测脑活动电学与化学维度的植入式神经接口。

现有电化学传感方法，如恒电位安培法和伏安法，在复杂脑环境中面临化学特异性不足的挑战。安培法虽时间分辨率高，但任何具有电活性的物质都会贡献电流，导致信号复合；伏安法虽能提供更丰富的电化学特征，但常受非法拉第背景电流和漂移影响，需背景扣除。此外，植入式电极的微型化导致有效传感面积缩小、界面阻抗升高，信噪比下降，且脑内高丰度电活性干扰物（如抗坏血酸）会掩盖目标信号。基于分子识别的适配体传感策略因其高选择性、可逆结合和化学稳定性，成为解决这些问题的有前景途径。然而，现有大多数电化学适配体传感器将工作电极（WE）、参比电极（RE）和对电极（CE）分离或外置，限制了空间精度，增加了手术复杂性，难以与电生理记录架构无缝集成。

**研究目的与意义**

为解决上述问题，研究人员开发了一种柔性多模态神经探针，将完整的片上三电极电化学适配体传感系统与宽带电生理记录接口集成在同一植入式平台中。通过金纳米结构（AuNS）电沉积优化电化学活性表面积（ECSA），并在AuNS工作电极上组装亚甲基蓝（MB）标记的多巴胺（DA）适配体，实现序列特异性分子识别。该平台在体外达到10 fM的检测限，并展现出高选择性。在急性大鼠尾壳核（CPu）实验中，通过静脉注射诺米芬辛（单胺再摄取抑制剂）升高细胞外DA浓度，同时记录电化学信号和电生理活动，验证了系统的多模态监测能力。该研究为神经化学与神经回路活动的联合研究提供了通用平台，有望推广至其他神经递质靶点，论文发表在《ACS Chemical Neuroscience》。

**主要关键技术方法（不超过250字）**

研究人员采用以下关键技术：1）基于聚酰亚胺（PI）的多层微加工工艺制备柔性神经探针，集成四个电生理记录微电极和两个片上三电极电化学系统，并通过铬（Cr）增强层提升机械性能，使用X射线计算机断层扫描（CT）验证内部结构。2）采用计时电流法在0.65 V（vs Ag/AgCl）下电沉积金纳米结构（AuNS）到工作电极（WE）上，以增大电化学活性表面积（ECSA）。3）将亚甲基蓝（MB）标记的DA适配体通过硫醇-金（Au–S）键自组装到AuNS修饰的WE上，并用6-巯基-1-己醇（6-MCH）钝化未占据的金位点。4）使用方波伏安法（SWV）进行电化学检测，优化频率为100 Hz。5）使用电化学阻抗谱（EIS）和X射线光电子能谱（XPS）表征界面组装。6）体内实验使用三只雄性Sprague–Dawley大鼠（8周龄，200–250 g，来自国家实验动物中心，台湾），将探针植入尾壳核（CPu），通过静脉注射诺米芬辛，采用时分复用策略（70秒周期：30秒电化学传感、10秒空闲、30秒电生理记录）进行多模态记录。

**研究结果**

**1. 多功能微电极阵列的电学与电化学表征**

通过电化学阻抗谱（EIS）评估，电生理记录微电极在1 kHz下的平均阻抗为366.02 ± 18.63 kΩ，探针间变异系数（CV%）为5.09%，表明制备重现性优良。在金纳米结构（AuNS）电沉积优化中，0.65 V沉积电位获得了最佳平衡：ECSA提升约4.7倍（从1.12×10³ μm²增至5.25×10³ μm²），探针间CV%低至2.02%，且避免了0.70 V下出现的过度侧向生长和短路风险。原子力显微镜（AFM）定量验证了表面粗糙度随电位增加，并与ECSA变化一致。亚甲基蓝（MB）标记的DA适配体在AuNS修饰电极上的氧化电流随ECSA增大而增加，表明增强的适配体负载和电子转移效率。

**2. 适配体在AuNS修饰工作电极上的表面化学与电化学表征**

X射线光电子能谱（XPS）证实了适配体通过Au–S键共价连接到金表面，表现为Au 4f谱中出现~87.4 eV的新组分，以及C 1s谱中C–O键贡献增加。电化学阻抗谱（EIS）的Nyquist图显示，AuNS修饰后电荷转移电阻（R_ct）较低（~3,255 Ω）；适配体固定后R_ct显著增加至~8,179 Ω，归因于核酸层形成的静电排斥和位阻；6-MCH钝化后R_ct降至~4,531 Ω，同时常相位角元件（CPE）的指数n从0.82恢复至0.85，表明界面从无序变为更有序的混合单层，而非简单的绝缘增厚。该结果通过EIS参数（R_ct、Q、n）的演化得到了定量支持。

**3. 体外电化学传感性能**

在人工脑脊液（aCSF）中，集成片上三电极系统相比传统三电极配置（外部RE和CE）表现出更优的灵敏度（1.3451 nA dec^–1 vs 0.3780 nA dec^–1）和更低的检测限（10 fM，基于3σ_blank标准）。在10 fM至1 μM范围内呈半对数线性校准（R² = 0.9884），并识别出两个绝对线性响应区域：0.5–10 pM（R² = 0.9945）和0.5–10 nM（R² = 0.9949）。选择性测试中，面对10³倍浓度的多种干扰物（包括L-DOPA、5-HT、DOPAC、HVA、UA、3-MT等）和10⁶倍浓度的抗坏血酸（AA），DA（1 pM）的响应仍显著高于所有干扰物（p < 0.001），且探针间和探针内CV%均低于3%，表明分子识别机制而非直接氧化。

**4. 间歇性电化学监测与脑仿体验证**

流动注射分析（FIA）系统显示，DA浓度从10 fM到1 pM递增时，SWV电流呈阶梯式增加，从1 pM回降至10 fM时信号可逆恢复，扫描间CV%始终低于10%。脑仿体（0.6%琼脂糖凝胶）实验中，探针插入4.5 mm深度后，DA从10 fM到100 pM的连续注入引起电流逐步上升，停止注入后信号逐渐下降，扫描间CV%仍低于10%，验证了在组织模拟环境中的稳定和可逆传感。

**5. 体内诺米芬辛诱导的神经化学与电生理响应的多模态表征**

在急性大鼠尾壳核（CPu）实验中，静脉注射诺米芬辛后，SWV电流从~14 μA迅速升至~22 μA，约600 s达峰，随后在35–50 min内逐渐恢复基线。同时，多单位活动（MUA）放电频率从~25个尖峰增至~100个，γ和γ′（高γ，91–300 Hz）频段LFP功率选择性增强，而低频段变化较小。盐水注射未引起显著变化。三只动物（N=3）的实验结果一致，峰值电流的动物间CV%仅为7.68%，而达峰时间因个体药代动力学差异而变异较大（CV% 33.25%），但整体趋势相同。体内信号幅值低于体外，归因于电极-组织界面阻抗升高和扩散限制，但扫描间重现性良好（CV% < 10%），表明平台能稳定跟踪药理学诱发的DA动态。

**6. 局限性与未来展望**

研究指出，急性实验验证了概念，但慢性植入面临适配体酶降解、生物污损、蛋白冠形成、硫醇-金键脱附以及Ag/AgCl参比电极（RE）银离子释放导致的细胞毒性和炎症反应等挑战。未来可通过防污涂层（如两性离子聚合物）、替代参考电极材料（如IrO_x、BDD）、简化电极配置（如两电极系统）以及间歇式传感范式来提升长期稳定性。

**结论部分翻译**

在本研究中，研究人员开发了一种柔性多模态神经探针，将电化学DA传感与电生理记录集成在单个微电极阵列平台上。该装置包含一个片上三电极电化学系统，由电沉积的Ag/AgCl参比电极、纳米结构铂对电极以及功能化DA特异性适配体的纳米结构金工作电极组成。该设计提供了稳定的电化学性能，具有高选择性、宽动态传感范围和实验验证的10 fM检测限。急性体内实验进一步证明，该平台能够检测药理学诱发的细胞外DA变化以及相应的神经元电活动改变。电化学传感和电生理记录按顺序进行，以避免测量干扰，同时在同一植入式神经接口内保留多模态能力。由于分子识别由适配体序列决定，该传感策略可通过适配体替换轻松扩展到其他神经化学靶点，为研究神经和精神疾病中的神经化学调节和神经回路活动提供了一个通用平台。