同时测定口服溶液中磺胺二甲氧嘧啶和奥美普林的稳定性指示高效液相色谱方法

《ACS Omega》：Stability-Indicating HPLC Method for Simultaneous Determination of Sulfadimethoxine and Ormetoprim in an Oral Solution

　　

研究人员开发并验证了一种稳定性指示高效液相色谱（HPLC）方法，用于同时测定口服溶液中的磺胺二甲氧嘧啶（SDM）和奥美普林（OMP）。色谱分离在C₁₈柱上实现，使用0.05%（v/v）磷酸水溶液和甲醇作为流动相，采用梯度洗脱，二极管阵列检测波长为275 nm。研究人员应用保留时间建模优化了两种分析物与强制降解研究中产生的九种降解产物（DPs）的分离。在优化色谱条件下，OMP和SDM的保留时间分别约为14.76 min和21.94 min。该方法根据ICH指南进行了特异性、线性、准确度、精密度和耐用性验证。OMP的平均回收率范围为98.62%至99.87%，SDM为99.74%至101.14%，两种分析物的%RSD均低于2%。所有评估的性能特征均符合预定的接受标准。在酸性、碱性、氧化、热和光解条件下的强制降解研究表明，分析物峰与降解产物分离良好，证明了该方法的稳定性指示能力。GAPI和AGREEprep评估显示中等绿色度，AGREEprep得分为0.40，而BAGI得分为72.5，表明实际适用性良好。该方法进一步应用于口服溶液的6个月加速稳定性研究。这些结果支持该程序适用于口服溶液中SDM和OMP的同时定量，以及在所研究条件下的稳定性评估。

**论文解读：稳定性指示HPLC方法同时测定口服溶液中磺胺二甲氧嘧啶和奥美普林**

**研究背景与研究问题**
球虫病（coccidiosis）由艾美耳属（*Eimeria*）多种寄生虫引起，是家禽业最具经济意义的疾病之一。感染艾美耳球虫会损伤肠道上皮细胞，破坏肠道稳态，导致腹泻、饲料效率降低、体重增长受阻及产蛋下降，在全球范围内造成巨大经济损失。抗球虫药物仍是家禽生产中控制该寄生虫病的主要手段。磺胺类药物（sulfonamides）和二甲氧嘧啶类（diaminopyrimidines）作为合成抗菌剂，已用于兽医学数十年，兼具抗菌和抗球虫活性。磺胺二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine, SDM）常与奥美普林（ormetoprim, OMP）联用，以实现协同效应并扩大抗菌谱。在美国，仅有含OMP-SDM的A型药预混剂被批准用于家禽预防球虫病和细菌感染。临床出现球虫病时，需及时治疗以限制经济损失，感染禽类常饮水减少、饮水量增加，因此通常通过饮水给药。但目前尚无商用OMP-SDM饮水给药复方制剂，研究人员在实验室中开发了一种口服溶液。稳定性指示分析方法在制剂开发和兽药审批中至关重要，可定量测定活性成分（APIs）在辅料、杂质和降解产物（DPs）存在下的含量。已报道的同时测定OMP和SDM的色谱方法主要针对加药饲料和生物基质，并非用于评估制剂稳定性；而已发表的稳定性指示方法涉及SDM与其他活性药物成分（APIs）联用，而非OMP。据研究人员所知，尚无同时测定口服溶液中SDM和OMP的稳定性指示HPLC方法报道。因此，本研究旨在开发一种能同时定量OMP和SDM、并能在其降解产物存在下评估制剂稳定性的HPLC方法。

**研究内容与结论**
研究人员开发并验证了一种稳定性指示HPLC方法，用于同时测定口服溶液中的SDM和OMP。该方法采用C₁₈色谱柱，以0.05%（v/v）磷酸水溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测波长为275 nm。通过保留时间建模优化了两种分析物与九种降解产物的分离。方法学验证涵盖系统适用性、特异性、线性、准确度、精密度和耐用性，所有指标均符合ICH Q2(R2)指南的预设标准。强制降解研究（酸性、碱性、氧化、湿热和光解条件）表明，分析物峰与降解产物峰分离良好，证实了方法的稳定性指示能力。该方法成功应用于口服溶液6个月加速稳定性研究，结果表明两种活性成分含量始终维持在初始值的95%–105%范围内。该方法的绿色化学评估（AGREEprep和GAPI）显示中等绿色度（AGREEprep得分0.40），实际适用性评估（BAGI）得分为72.5，表明方法具有良好的实际可操作性。该研究发表在《ACS Omega》。

**主要关键技术与方法**
研究人员采用的主要关键技术包括：（1）梯度洗脱HPLC方法，使用Agilent 1260系统配二极管阵列检测器（DAD），色谱柱为Eclipse XDB C₁₈（4.6 mm × 250 mm, 5 μm），柱温35°C，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，检测波长275 nm；（2）基于R语言的保留时间建模与优化，利用gfitk()和gopt()函数预测并优化梯度程序，最终梯度为0–2 min 10%甲醇，2–20 min线性升至45%甲醇，20–25 min保持45%甲醇；（3）强制降解研究，包括酸水解（2 mol/L HCl，70°C，2 h）、碱水解（2 mol/L NaOH，70°C，7 d）、氧化（6% H₂O₂，70°C，7 d）、湿热（去离子水，70°C，7 d）和光解（直接阳光，14 d）；（4）方法学验证遵循ICH Q2(R2)指南，评估系统适用性、特异性、线性、检测限（LOD）和定量限（LOQ）、准确度（加标回收）、精密度（重复性和中间精密度）及耐用性；（5）绿色化学评估使用AGREEprep、GAPI和BAGI工具。样本来源：口服溶液由河北科星制药有限公司（中国河北）生产，SDM和OMP标准品由江苏天和制药有限公司（中国江苏）提供。

**研究结果**
**2.1 方法开发与优化**
**2.1.1 色谱分离优化**：通过强制降解生成九种降解产物，并使用宽梯度筛选获得所有组分的洗脱概貌。随后设计五个额外梯度程序，收集保留时间并构建保留模型。R语言gopt()函数优化梯度，最终选择梯度时间（t_G）为18 min，梯度程序为0–2 min 10%甲醇，2–20 min线性升至45%甲醇，20–25 min 45%甲醇。实验验证表明，在此条件下目标分析物与降解产物分离良好，仅DP7拟合较差但仍成功分离。该方法介于传统试错法和全面分析质量源于设计（AQbD）之间，为开发含多API和DP的制剂稳定性指示HPLC方法提供了实用参考。
**2.1.2 波长选择**：评估220–300 nm范围内OMP和SDM的峰面积响应。OMP在220 nm处吸收最大，SDM在270 nm处吸收最大。低于245 nm时出现干扰峰，因此选择260–280 nm，最终选定275 nm为检测波长，兼顾两种分析物的灵敏度。

**2.2 方法验证**
**2.2.1 系统适用性**：六次重复进样显示，OMP和SDM保留时间分别约为14.73和21.94 min，%RSD均小于0.4%；理论塔板数均超过8000；拖尾因子在0.8–1.8之间；OMP与邻近小峰分离度均值为2.62，OMP与SDM分离度均值为34.97，均大于1.5，符合系统适用性标准。高浓度OMP（30 μg/mL）出现拖尾，通过添加三乙胺（0.1%，v/v）并调节pH至2.7可改善，但导致基线波动，最终稀释至3 μg/mL后峰形显著改善。
**2.2.2 特异性**：比较空白、单独标准溶液、混合标准溶液、测试溶液和加速稳定性样品溶液的色谱图，OMP和SDM保留时间无显著偏移（±0.01 min），峰纯度分析表明无共洗脱杂质，空白无干扰。
**2.2.3 LOD、LOQ和线性**：SDM的LOD为0.02 μg/mL，LOQ为0.10 μg/mL；OMP的LOD为0.05 μg/mL，LOQ为0.15 μg/mL。在80%–120%标示浓度（OMP 2.4–3.6 μg/mL，SDM 12–18 μg/mL）范围内，两种分析物均呈良好线性，R²分别为0.9996（OMP）和0.9993（SDM）。稀释剂选择50%（v/v）甲醇水溶液以避免溶剂效应。
**2.2.4 准确度和精密度**：OMP平均回收率98.62%–99.87%，SDM平均回收率99.74%–101.14%，%RSD均低于2%。重复性和中间精密度研究中，两种分析物六次制备的%RSD均低于2%。
**2.2.5 耐用性**：流速、有机相比例、检测波长和柱温的微小变化主要影响峰面积和保留时间，但所有系统适用性参数仍符合预设标准，表明方法在所研究范围内耐用。

**2.3 强制降解研究**
OMP-SDM混合物的强制降解条件基于初步实验确定：酸水解（2 mol/L HCl，2 h）使SDM降解15.16%，OMP降解2.46%；碱水解（2 mol/L NaOH，7 d）使SDM降解12.92%，OMP降解2.09%。主要降解产物（保留时间约8 min）通过光谱比较初步认定为SDM的羟基衍生物，可能由ε-裂解产生。氧化、湿热和光解条件下OMP和SDM含量变化极小（剩余98.64%–100.53%），延长暴露时间后仍无明显降解。所有强制降解条件下，分析物峰与降解产物峰分离良好，峰纯度分析支持无共洗脱杂质。研究中未进行质谱或核磁共振表征，限制了降解产物的进一步定量。

**2.4 加速稳定性研究应用**
将方法应用于6个月加速稳定性研究（40°C），OMP和SDM的回算含量分别为28.76–30.40 mg/mL和147.38–150.69 mg/mL，均维持在初始值的95%–105%范围内。主要降解产物DP2的峰面积随时间增加。

**2.5 绿色化学与适用性评估**
AGREEprep和GAPI评估显示中等绿色度（AGREEprep得分0.40），主要归因于使用甲醇、DMSO和磷酸等有害试剂以及样品制备产生的较大废液量。BAGI评估得分为72.5，表明方法实际适用性良好，但样品通量较低（运行时间长）。未来可通过缩短色谱柱、转用UHPLC或更快梯度减少分析时间和溶剂消耗，进一步鉴定降解产物可能允许将方法扩展为同时测定API和杂质。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本方法开发策略遵循结构化工作流程，包括强制降解、保留时间建模、梯度优化和实验验证，是一种介于传统试错法和全面AQbD之间的中间方法，所需实验较少但参数相互作用理解有限。研究局限包括未鉴定降解产物结构、未定量降解产物、以及方法通量较低。翻译研究结论部分如下：本研究建立了一种简单、高效的稳定性指示HPLC方法，用于同时测定口服溶液中的OMP和SDM。利用R语言辅助的保留时间建模实现了目标分析物与其降解产物的满意分离。开发的方法根据ICH Q2(R2)指南进行了验证，所有评估的性能特征均符合预定接受标准。在酸性、碱性、湿热、氧化和光解条件下的强制降解研究通过证明分析物峰与降解产物峰的分离，支持了该方法的稳定性指示能力。该方法成功应用于OMP-SDM口服溶液的加速稳定性研究，适用于所研究条件下的稳定性评估。