人iPSC来源的脊髓类器官——神经元成熟的首次电生理评估

《ACS Chemical Neuroscience》：Human iPSC-Derived Spinal Cord Organoids – The First Electrophysiological Assessment of Neuronal Maturation

　　

脊髓具有复杂的细胞构筑和神经元回路组织，这对在体外复制其功能完整性构成了挑战。在本研究中，研究人员采用先前发表的方案，从人诱导多能干细胞（human-induced pluripotent stem cells，hiPSCs）生成脊髓类器官（spinal cord organoids，SCOs），并利用定量电生理方法表征了SCO神经元在早期发育阶段（培养第15–32天）功能神经元特性的表型变化。研究人员采用全细胞膜片钳技术评估电生理特性，发现SCO神经元表现出渐进性成熟，证据包括静息膜电位超极化、内向电流幅值增加、动作电位动力学优化以及成熟型放电模式的早期出现。特别值得注意的是，研究人员发现运动神经元中常见的锋电位频率适应性（spike frequency adaptation，SFA）现象在SCO神经元发育早期即已出现。免疫组织化学评估证实了运动神经元关键转录因子（ISLET1和HB9）以及未成熟脊髓中间神经元标志物（LHX1/5和PAX2）的表达。综上，研究结果表明hiPSC来源的SCO神经元表现出生理性分化，这对利用SCO研究人类脊髓发育以及推进中枢神经系统疾病和细胞替代疗法的转化研究具有重要意义。

**人iPSC来源的脊髓类器官的神经元成熟电生理特征——研究解读**

**一、研究背景与意义**

脊髓是中枢神经系统的重要组成部分，承担着感觉信息向高级脑中枢的传递以及下行运动指令的传导功能。这些复杂功能依赖于其精细的细胞构筑和神经元回路组织。在发育过程中，脊髓建立前后轴、背腹轴和内外侧轴三个主要轴向，其中背腹轴的形成受形态发生素（如Sonic Hedgehog和骨形态发生蛋白）的严格调控。腹侧产生的运动神经元根据肌肉靶标聚集为特异性运动神经元池，而背侧的感觉中间神经元则呈现与感觉模态相关的层状组织。这种复杂性极大地阻碍了三维脊髓多神经元培养体系的体外构建。

人诱导多能干细胞（human-induced pluripotent stem cells，hiPSCs）为生成模拟中枢神经系统特定区域结构和分子特性的自组织三维神经类器官提供了有效平台。脊髓类器官（spinal cord organoids，SCOs）在脊髓性肌萎缩、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化及其他脱髓鞘疾病和脊髓损伤的病理生理研究中具有重要应用前景。然而，既往对hiPSC来源成熟SCOs的电生理评估主要采用多电极阵列（multielectrode arrays，MEAs）技术，因为全细胞膜片钳记录方法因类器官尺寸和可及性限制在技术上难以应用。因此，关于SCOs神经元成熟早期阶段、过渡性变化和新兴表型的信息十分匮乏。本研究旨在通过对完整SCOs内单个神经元进行全细胞膜片钳记录，提供神经元成熟相关的电生理特性的首次详细功能表征。

**二、主要技术方法**

研究人员采用已发表的方案（Ogura等）生成脊髓类器官，使用人iPSC系HPSI0114i-vabj_3（Wellcome Trust Sanger Institute，英国）。类器官培养至第32天，在体外培养第15天（DIV15）、第24天（DIV24）和第32天（DIV32）三个时间点，对直径200至600 μm的完整类器官中的神经元进行全细胞膜片钳记录。电压钳模式记录电压门控Na⁺和K⁺通道介导的内向和外向电流，电流钳模式评估被动膜特性和动作电位。形态学重建采用Alexa Fluor 488荧光染料结合荧光显微镜成像。免疫组织化学使用针对神经元和胶质细胞标志物的抗体对DIV24和DIV32类器官切片进行染色分析。统计分析采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）后接Bonferroni事后检验。

**三、研究结果**

**1. hiPSC来源SCOs神经元被动膜特性表征**

研究人员分析了记录的134个神经元中54个显示电压依赖性膜电流激活的神经元的被动膜特性。膜电容在DIV15至DIV24显著增加，随后在DIV24至DIV32下降。膜电阻约0.2 GΩ，随培养时间无显著变化。静息膜电位（resting membrane potential，RMP）随SCOs成熟趋于更负，DIV15与DIV32之间存在显著差异。膜时间常数在DIV15与DIV24之间显著增加。

**2. 跨膜电流分析**

记录的SCO神经元对去极化刺激产生稳健的内向和外向跨膜电流。内向电流激活电压阈值（Vt）在DIV15与DIV24以及DIV15与DIV32之间存在显著差异。内向电流幅值在DIV15最低，DIV24显著增加，DIV32再次下降。峰值电流密度在DIV24最高，DIV15与DIV24以及DIV24与DIV32之间有显著差异。电流-电压（I-V）关系曲线显示DIV24和DIV32的峰值电流激活位于更负的电位。

**3. SCOs神经元动作电位特性**

各阶段大多数记录的神经元在电流钳模式下注入去极化阶跃电流时可产生单个或多个动作电位（action potentials，APs）。DIV15时大多数神经元发放单个AP，而DIV24和DIV32约半数神经元发放多个AP。AP幅值在DIV24显著大于DIV15和DIV32。AP动力学参数分析显示，与DIV15相比，DIV32的tau上升显著降低，tau衰减从DIV15到DIV32显著减少，表明复极化逐渐加快，符合神经元成熟的趋势。

**4. 后超极化（AHP）特性**

后超极化（afterhyperpolarization，AHP）幅值在不同培养时间点无显著变化，而AHP半高峰宽（fwhm）在DIV24较DIV15显著增加。AHP的动力学特性无显著变化。

**5. AP放电模式**

研究人员分析了AP频率-电流曲线（f-I曲线）、瞬时频率、锋电位频率适应性（spike frequency adaptation，SFA）系数和规律性指数。DIV24（n = 17）和DIV32（n = 11）神经元的规律性和SFA系数分析显示早期AP放电模式伴有SFA现象。尽管这些序列是阵发性的（非规律性），因此在此时间点不能称为已确立的模式，但在两组中均观察到。大多数AP放电模式表现出高度不规则性。

**6. 免疫组织化学表征**

TUJ1（一般神经元标志物）染色显示DIV24和DIV32类器官切片中神经元胞体密集分布。ISLET1（未成熟运动神经元标志物）阳性细胞在两种时间点均存在。PAX2标记在DIV24和DIV32类器官中均检测到。LHX1/5阳性细胞大簇在DIV24类器官中观察到，而DIV32类器官中无可检测信号。HB9（有丝分裂后运动神经元标志物）与MAP2或NeuN共染色显示HB9阳性神经元亚群，表明两种时间点的类器官已含有半成熟运动神经元。GFAP（胶质细胞标志物）稀疏表达，表明胶质成熟在此阶段有限。

**四、讨论与结论总结**

**讨论部分总结：** 本研究首次在保持三维结构和完整细胞微环路的完整类器官中对具有预定形态的单个神经元进行全细胞电生理记录。研究发现从分化第2周起，SCOs神经元膜特性和兴奋性状态出现渐进性过渡变化，可定义为SCOs神经元成熟的关键期。RMP随培养时间趋于超极化，与发育中的人类胚胎干细胞来源运动神经元的成熟相关变化一致。内向电流在DIV24的幅值显著增大，表明Na⁺通道亚型转换和活性通道数量动态增加。AP波形和放电模式分析显示神经元在培养过程中产生更复杂波形和重复放电的能力增强。SFA现象在DIV24已出现，而SFA是脊髓运动神经元的特征性放电模式，提示早期功能身份的确立。免疫组织化学证实多种神经元类型的存在，包括未成熟和半成熟运动神经元以及不同类型的脊髓中间神经元，为电生理特征提供了分子背景。

**结论部分翻译：** 本研究证明hiPSC来源的脊髓类器官（SCOs）重现了人类脊髓早期发育的关键电生理特征。SCO神经元表现出渐进性成熟，证据为静息膜电位超极化、电压依赖性内向电流幅值增加、动作电位动力学优化以及特定放电模式的早期出现。特别值得注意的是，研究人员观察到SFA现象在部分SCO神经元中于神经元发育早期即已出现。此外，运动神经元特异性标志物的丰富表达支持该模型的生理相关性。总体而言，研究结果确立了hiPSC来源的SCOs作为研究人类脊髓发育以及推进中枢神经系统疾病和细胞替代疗法转化研究的稳健体外平台。