γ射线灭菌对三维打印壳聚糖-生物活性玻璃支架在周围神经组织工程中性能的影响

《ACS Applied Bio Materials》：Effect of Gamma Ray Sterilization on the Properties of Three-Dimensional Printed Chitosan–Bioactive Glass Scaffolds for Peripheral Nerve Tissue Engineering

　　

灭菌是医疗器械临床应用的先决条件。γ辐照是一种高穿透性、低温的生物材料处理工艺。然而，该工艺可能改变材料的性能，从而潜在地影响其功能表现。本研究采用临床相关的γ辐照剂量（15和25 kGy）处理三维（3D）打印的壳聚糖-生物活性玻璃支架，并评估其在神经组织工程中的应用潜力。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、差示扫描量热法（DSC）、扫描电子显微镜（SEM）、力学测试、溶胀及降解实验进行理化表征。利用相关细胞系通过间接细胞毒性实验评估生物学性能，并辅以黏附及形态学分析。FTIR和DSC分析表明，辐照同时诱导了结构重排和分子间相互作用增强。这些变化提高了力学性能、降低了液体吸收并减缓了支架降解。此外，高细胞活力和黏附性表明细胞相容性得以保留。总体而言，γ射线不仅可用于灭菌，还可改善支架的结构和机械完整性，支持其在神经组织工程应用中的潜力。

**论文解读：γ射线灭菌对三维打印壳聚糖-生物活性玻璃支架性能的调控及其在周围神经组织工程中的应用前景**

**一、研究背景与目的**

灭菌是医疗器械临床应用的强制性前提，监管机构要求通过严格的验证程序以消除微生物、降低感染风险并保障患者安全。现有灭菌技术包括湿热、干热、环氧乙烷及电离辐射等，其中γ辐照因具有高穿透性、低热效应以及可对包装产品实现均匀灭菌等优势而被广泛应用。然而，γ射线在灭活微生物的同时，也可能通过电离作用在生物材料中产生自由基、离子及激发态等活性中间体，进而引发高分子材料的化学结构改变，主要表现为链断裂与交联/网状化两种竞争性反应。这两种反应的相对优势取决于辐照剂量和材料本身特性，因此对γ辐照后的生物材料进行全面的理化及功能评估不可或缺。

周围神经损伤后的再生是组织工程领域的持续性挑战，神经引导导管（nerve guidance conduits）的开发为该难题提供了重要策略。壳聚糖（chitosan）作为一种由甲壳素脱乙酰化得到的天然多糖，因其能够提供支持细胞发育的仿生微环境，且其降解产物对神经组织具有抗炎作用，成为构建神经导管的理想候选材料。然而，γ辐照对纯壳聚糖的作用以链断裂为主，可能导致材料性能劣化。已有研究表明，通过引入其他组分形成共混物或复合材料，可调控辐照反应方向，使其倾向于交联。生物活性玻璃（bioactive glass, BG）作为一种能够增强聚合物网络互连性的无机添加剂，在壳聚糖基支架中可改善力学性能、调节溶胀与降解速率并增强细胞-材料相互作用。尽管BG常用于硬组织修复，但其释放的离子已被证明可改善软组织再生，包括促进神经突生长、维持施万细胞（Schwann cell）的再生表型以及改善大鼠模型的神经功能恢复。基于此，本研究旨在开发三维（3D）打印壳聚糖-BG复合支架，系统评估临床相关剂量（15和25 kGy）的γ辐照对支架理化性能和生物学性能的影响，以优化其在周围神经组织工程中的应用潜力，并填补关于辐照支架热学行为及神经相关细胞响应的研究空白。

**二、主要技术方法概述**

研究人员采用溶胶-凝胶法合成名义组成为58SiO₂–33CaO–9P₂O₅（wt %）的生物活性玻璃，经冻干、煅烧、球磨筛分得到粒径<45 μm的颗粒，并在DMEM中预调理以减弱初始离子爆释。以醋酸、乳酸和柠檬酸混合溶剂体系配制含壳聚糖和BG的可打印墨水，通过挤出式3D打印制备5层、排列整齐的矩形结构支架。辐照处理在钴-60 γ腔室中进行，剂量率为8.881 kGy/h，施加15和25 kGy两种临床灭菌剂量，并以紫外（UV）消毒组作为对照。表征手段包括傅里叶变换红外光谱（FTIR）、差示扫描量热法（DSC）、扫描电子显微镜（SEM）及能谱分析（EDS）、拉伸力学测试、溶胀实验和体外降解实验。生物学评估采用大鼠嗜铬细胞瘤来源的神经元样PC12细胞系（ATCC CRL-1721）和大鼠施万细胞瘤来源的RT4-DGP2T细胞系（ATCC CRL-2768），通过间接细胞毒性实验（resazurin还原法和结晶紫染色法）及直接黏附实验评价支架的细胞相容性。

**三、研究结果**

**3.1 结构表征**

FTIR光谱显示，γ辐照后支架在895 cm^-1处对应糖苷环的谱带强度降低，表明辐照诱导了糖苷键断裂和聚合物分子量降低；与此同时，1500–1300 cm^-1区域末端基团（–CH₃和–NH₂）相关谱带增强，进一步支持链断裂的发生。辐照样品在3350 cm^-1处谱带强度增加，提示分子间氢键作用增强。此外，946 cm^-1处Si–OH振动谱带受到抑制，而870 cm^-1处对应仅含非桥氧（NBO）的硅氧四面体单元谱带增强，表明BG网络内部发生结构重排。

**3.2 热学行为**

DSC分析显示，γ辐照后第一个吸热峰（对应物理吸附水蒸发）从约175 °C分别移至167 °C（15 kGy）和157 °C（25 kGy），表明链断裂促进了水的释放。放热降解峰则向更高温度移动（15 kGy组260–320 °C，25 kGy组250–315 °C），且第二个与BG中孔道水或化学吸附水去除相关的吸热转变消失，仅呈现微弱肩峰，说明辐照增强了材料的整体热稳定性。

**3.3 力学性能**

拉伸测试结果表明，γ辐照后支架的弹性模量和极限抗拉强度（UTS）均增加：弹性模量从非灭菌组的1.18 ± 0.21 MPa提高至15 kGy组的1.85 ± 0.19 MPa和25 kGy组的1.58 ± 0.33 MPa，UTS从0.88 ± 0.14 MPa分别提高至1.05 ± 0.08 MPa和1.08 ± 0.26 MPa，而断裂伸长率基本保持不变。对比无BG的纯壳聚糖支架，15 kGy辐照后拉伸性能反而下降，25 kGy组仅略高于未辐照对照，提示BG的引入对辐照后力学增强具有关键贡献。

**3.4 微观结构分析**

SEM观察显示，所有组别支架表面均均匀分布有颗粒，表明BG在支架中分散良好。γ辐照后，特别是25 kGy组，表面粗糙度明显增加。截面图像显示颗粒分布于材料内部，伴随少量孔隙，灭菌处理未引起截面的明显变化。EDS元素mapping确认了C、O、Si、Ca和P的存在，表面颗粒对应BG团聚体（富Si区域）或加工过程中形成的富钙相。

**3.5 溶胀与体外降解**

溶胀实验显示，所有组别均在2小时内快速吸水后趋于稳定。24 h时，N/S和UV组的溶胀率约为350%，γ辐照组则呈剂量依赖性降低（15 kGy组337%，25 kGy组318%），但支架仍保持亲水性。体外降解实验表明，14天后N/S、UV和15 kGy组的失重率相近（约16%），而25 kGy组失重率较低（约13%）。辐照组在2–7天降解较慢，7–14天降解加速，与未辐照组的近似线性降解行为不同。

**3.6 生物学评价**

间接细胞毒性实验显示，所有支架组对PC12和RT4两种细胞系的细胞活力均高于95%，无细胞毒性效应。对于PC12细胞，resazurin还原实验显示γ辐照组的代谢活性较UV组略有升高（15 kGy组97 ± 7%，25 kGy组102 ± 3%），而结晶紫染色实验显示各组间膜完整性无显著差异。RT4细胞在各组间代谢活性相近（96–102%），膜完整性均保持较高水平。直接黏附实验和FESEM观察显示，PC12和RT4细胞均能良好地黏附于γ辐照支架表面，未出现形态学应激迹象，RT4细胞呈现典型形态并形成融合单层。

**四、讨论与结论**

研究表明，γ辐照对壳聚糖-BG复合支架的作用是链断裂与结构重排共存的过程。辐照引起的壳聚糖链断裂可能促进基体重新排列，使壳聚糖的氢供体基团（–OH、–NH₂）、BG表面的硅醇基团以及柠檬酸羧基之间形成更强的分子间相互作用，具体包括壳聚糖氨基与BG表面硅醇/NBO位点间的静电相互作用（离子交联）、氢键物理相互作用以及多糖与柠檬酸间可能的共价二酯键。这些增强的界面相互作用是辐照后支架力学性能提升、溶胀率下降和降解速率减慢的主要原因。对比无BG支架的力学结果进一步证实，仅壳聚糖和柠檬酸之间的相互作用不足以解释复合支架的增强效应，聚合物-BG界面的额外相互作用贡献显著。

在周围神经修复的应用背景下，辐照支架的力学性能虽低于人体胫神经（弹性模量约9.5 MPa，UTS约3.91 MPa），但处于同一数量级，且增强后的性能更接近天然组织需求。溶胀率降低和降解减缓有利于神经导管在植入后至少14天内维持结构完整性，为轴突再生提供必要的时间窗口。生物学评估证实，γ辐照保留了支架的细胞相容性，所有组别均维持高细胞活力和良好细胞黏附，且辐照支架上PC12细胞代谢活性略有升高，可能与BG释放的生物活性离子有关。表面粗糙度的增加被推测对细胞黏附具有积极作用。

**研究结论**：γ辐照是医疗器械有效且常用的灭菌方法，但其应用于聚合物基生物材料时可能显著改变其理化及生物学性能。本研究考察了常用于灭菌的15和25 kGy辐照剂量对3D打印壳聚糖-BG支架的影响，尤其关注其用于周围神经组织工程的适用性。FTIR和DSC分析揭示了辐照诱导壳聚糖和BG的结构修饰，并改变了支架组分间的相互作用，这些变化与辐照引起的基体重排和分子间相互作用增强相一致。力学行为、溶胀、降解和微观结构特征评估证实，辐照后支架的力学强度（UTS和弹性模量）提高、液体吸收减少、降解减慢（特别是25 kGy组），且表面粗糙度增加。重要的是，γ辐照未损害支架的生物学性能：所有组别均保持高细胞活力和黏附性，BG离子释放可能增强了细胞代谢。总体而言，15和25 kGy两种辐照剂量均改善了壳聚糖-BG支架在神经组织工程应用中的相关性能。未来工作应进一步研究BG-壳聚糖支架对神经组织的影响，包括治疗性离子释放和体内再生性能，以巩固其转化应用潜力。