结合狂热火球菌Argonaute蛋白的阻断剂引物辅助LAMP技术，可实现对NSCLC中EGFR突变的特异性和高灵敏度检测

《Analytical Chemistry》：Blocker Primer-Assisted LAMP Coupled with Pyrococcus furiosus Argonaute Enables Specific and Sensitive Detection of EGFR Mutations in NSCLC

　　

摘要

在循环肿瘤DNA中检测低频突变一直是个重大挑战，因为突变等位基因通常仅占血浆中总游离DNA的不到1%。在此，我们提出了一种结合了Pyrococcus furiosus Argonaute（PfAgo）的阻断引物辅助环介导等温扩增技术，用于检测与非小细胞肺癌相关的EGFR突变。该技术在LAMP反应中加入了阻断引物，以选择性抑制野生型基因的扩增，从而富集突变体产生的扩增产物。这些突变体扩增产物随后会被PfAgo识别并切割。所产生的切割片段可作为二级引导序列，触发荧光探针的切割，进而实现信号级的放大。该技术能够在强烈的野生型背景（每微升总DNA中有1×10⁶个拷贝）下，检测到浓度低至0.05%的EGFR L858R、T790M和19del突变等位基因，并且能够可靠地在肺癌细胞系中检测到目标突变。在临床血浆样本中，与下一代测序技术相比，该技术检测EGFR L858R的灵敏度为84.62%，特异性为100%。这些结果表明，这种阻断引物辅助LAMP结合PfAgo的技术是一种用于CTDNA突变分析的高灵敏度、高特异性方法，有望应用于液体活检领域。