单碱基分辨率定量m6A图谱揭示细菌中m6A的动态重编程、进化保守性与转录调控

《Cell Reports》：Quantitative single-base m6A profiling reveals dynamic reprogramming, evolutionary conservation and transcriptional regulation in bacteria

　　

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中广泛存在的RNA修饰，可调控RNA代谢，但其在细菌中的分布与功能仍不明确。研究人员应用GLORI测序（glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosines）在七种细菌物种中生成了转录组范围的单碱基分辨率m6A图谱。在指数生长期鉴定出2845个m6A位点，并在三个菌株中发现广泛的依赖培养条件的甲基化动态变化。在丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）中，m6A重塑与毒力相关通路相关。比较分析揭示了455对保守m6A位点，富集于生长、能量代谢和跨膜运输所需基因中。整合甲基化、转录本丰度与RNA稳定性分析表明，m6A与mRNA丰度降低和RNA稳定性增加相关。研究人员进一步鉴定出rRNA甲基转移酶RlmF和RlmJ作为细菌mRNA m6A的书写酶（writer）。这些发现提供了细菌m6A的定量图谱，并为理解其调控与进化作用奠定基础。

研究背景方面，N⁶-甲基腺苷（m⁶A）作为真核生物中最丰富的RNA修饰，通过METTL3-METTL14复合体（书写酶writer）、YTH结构域蛋白（阅读器reader）及FTO、ALKBH5（擦除器eraser）实现可逆调控，影响mRNA稳定性、翻译与剪接。在细菌中，m⁶A是否存在于mRNA、由何种酶催化、是否具有功能一直存在争议：早期质谱检测到低比例m⁶A/A（0.02%–0.28%），PA-m⁶A-seq发现非DRACH motif（如GCCAG），而近期研究质疑其重复性，认为可能随机发生。传统抗体法（MeRIP-seq）分辨率低且不能定量，纳米孔直接RNA测序（DRS）算法一致性差。因此，建立单碱基、可定量的细菌m⁶A图谱是回答上述争议的关键。该研究发表于《Cell Reports》，研究人员利用优化GLORI技术对七种细菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌）进行转录组范围单碱基m⁶A定量，得出细菌m⁶A具有物种特异性分布、生长阶段动态重编程、跨物种保守位点、与mRNA丰度负相关且与稳定性正相关，并由rRNA甲基转移酶RlmF/RlmJ兼作mRNA书写酶等结论，填补了细菌表观转录组定量图谱空白。

主要关键技术方法包括：采用GLORI测序（化学脱氨未甲基化A为I→读为G，m⁶A抗脱氨保留A）实现单碱基绝对定量；对总RNA经探针法rRNA去除（RiboRid）后建库，七种细菌涵盖革兰阴/阳性、模型菌与病原/食品菌；样本队列包括七种菌指数期总RNA，其中大肠杆菌、铜绿假单胞菌、丁香假单胞菌追加静止期及丁香假单胞菌在King’s B（KB）富营养与minimal medium（MM）最小培养基毒力诱导条件；位点筛选要求覆盖>15×、修饰分数>0.1且两重复交集；23S rRNA已知A1618/A2030位点作阳性验证；结合RNA-seq测转录丰度、利福平追踪RNA稳定性、BLAST比对RlmF/RlmJ同源、VFDB毒力基因注释。

研究结果部分，“m⁶A sites A1618 and A2030 on E. coli 23S rRNA are conserved in Gram-negative but absent in Gram-positive bacteria”小节中，研究人员通过多序列比对发现大肠杆菌23S rRNA的A1618与A2030在七种菌同源位点为A；GLORI显示四株革兰阴性菌该两位点保留A（甲基化水平0.86–0.99），三株革兰阳性菌转为G（未甲基化）；BLAST表明RlmF/RlmJ同源物仅存于革兰阴性菌，解释甲基化缺失，证明GLORI可用于细菌rRNA/mRNA单碱基检测。“Base-resolution mRNA m⁶A maps across bacterial species identified by GLORI”小节中，rRNA去除后GLORI转换率0.96–0.99，重复间Pearson>0.88；七菌m⁶A位点数为97（肺炎克雷伯菌）至874（金黄色葡萄球菌），中位修饰分数0.27–0.82；位点富集于CDS（大肠杆菌近CDS边界），含m⁶A基因显著更长，motif无单一优势（CRAUC占7.1%），区别于真核DRACH。“Growth-phase-dependent dynamics and reprogramming of bacterial mRNA m⁶A methylomes”小节中，静息期位点数比指数期增6.2%–128%，丁香假单胞菌静息期整体水平升高；共有位点修饰高于特有位点；±15%阈值下15.5%–65.7%位点表现阶段动态（铜绿/丁香以stat-hyper为主，大肠杆菌以exp-hyper为主）。“Enhanced m⁶A methylation levels of virulence factors in P. syringae under KB medium”小节中，丁香假单胞菌KB vs MM条件下m⁶A重叠有限，KB特异修饰基因GO富集于毒力相关通路，hopD1等毒力基因位点修饰在KB中更高，表明m⁶A重塑关联毒力调控。后续比较分析获455对保守m⁶A位点对，富集生长/能量代谢/跨膜运输；整合稳定性实验显示m⁶A位点mRNA丰度低但半衰期长；ΔrlmF/ΔrlmJ突变体m⁶A/A比下降，证实RlmF与RlmJ为细菌mRNA m⁶A书写酶。

讨论与结论翻译浓缩：研究人员指出，该研究首次提供七种细菌单碱基定量m⁶A图谱，解决此前技术局限导致的“随机性”误判；细菌m⁶A虽无严格DRACH但呈局部聚集与CDS偏好，具生长阶段与培养条件依赖的重编程，部分位点跨物种保守且定位于核心功能基因，提示进化约束下的调控潜能；m⁶A与mRNA丰度降低及稳定性增加相关，不同于真核典型降解导向；RlmF/RlmJ原本注释为rRNA甲基转移酶，现证实兼催化mRNA m⁶A，拓展了对原核RNA修饰酶底物广度的认识。研究意义在于为细菌表观转录组建立了可重复定量基准，并为后续解析m⁶A在细菌生长、毒力与适应中的因果机制提供靶标地图。