外侧导水管周围灰质谷氨酸能神经元对快速眼动睡眠和觉醒的控制

《Cell Reports》：Control of REM sleep and wakefulness by lateral periaqueductal gray glutamatergic neurons

　　

快速眼动睡眠（REM sleep）被认为是一种比非快速眼动睡眠（NREM sleep）更接近觉醒的皮层状态，然而仅有少数脑区同时调控这两种状态。本研究通过光纤光度测定和光电极记录，识别出外侧导水管周围灰质（LPAG）中的谷氨酸能神经元，这些神经元在觉醒和快速眼动睡眠期间被特异性激活。化学遗传学抑制LPAG囊泡谷氨酸转运体2（Vglut2）神经元减少了快速眼动睡眠和觉醒，同时增加了非快速眼动睡眠；其激活则诱导了觉醒，伴随高θ波功率和不动状态。化学遗传学抑制LPAG-下背外侧被盖核（SLD）投射缩短了快速眼动睡眠，而其光遗传学激活则触发了快速眼动睡眠，证明该通路驱动快速眼动睡眠。同时，LPAG^Vglut2神经元通过输出至蓝斑（LC）和腹侧巨细胞网状核（GiV）促进觉醒，光遗传学操作支持了这一结论。总体而言，研究结果表明LPAG^Vglut2环路既调控快速眼动睡眠也调控觉醒，揭示了一个参与调控快速眼动睡眠和觉醒的关键区域。

**论文解读：外侧导水管周围灰质谷氨酸能神经元对快速眼动睡眠和觉醒的双重调控**

**研究背景与目的**
快速眼动睡眠（REM sleep）因其脑电图（EEG）特征与觉醒相似，被称为“悖论睡眠”，但仅有少数脑区同时调控REM睡眠和觉醒。外侧导水管周围灰质（LPAG）是中脑导水管周围灰质的一部分，已知参与防御行为、疼痛、心血管调控等多种功能，但其在睡眠-觉醒调控中的作用尚不明确。前期研究通过c-Fos全脑图谱发现，LPAG在REM睡眠剥夺及恢复期间被激活，提示其可能参与REM睡眠和觉醒的协调。然而，LPAG中具体何种神经元类型及神经环路机制未知。本研究旨在阐明LPAG谷氨酸能神经元在REM睡眠和觉醒调控中的功能及下游神经通路。

**研究内容与结论**
研究人员采用c-Fos免疫组化结合原位杂交技术，在大鼠和小鼠中证实LPAG谷氨酸能神经元（以囊泡谷氨酸转运体2，Vglut2为标记）在REM睡眠剥夺（RSD）和总睡眠剥夺（SD）期间被激活。通过光纤光度测定和光电极记录，发现LPAG^Vglut2神经元在自发睡眠-觉醒周期中，觉醒期活性最高，REM睡眠期中等，NREM睡眠期最低，且其活性在NREM-觉醒和REM-觉醒转换前升高。化学遗传学抑制LPAG^Vglut2神经元（使用hM4Di）显著减少REM睡眠（约35%）和觉醒，增加NREM睡眠；而化学遗传学激活（使用hM3Dq）则强烈促进觉醒（增加约195%），同时减少NREM和REM睡眠，并伴随高θ波功率和不动状态。光遗传学激活LPAG^Vglut2神经元同样可快速诱导NREM睡眠向觉醒转换，并维持觉醒状态达1小时，同时降低肌电活动。顺行示踪（AAV-hrGFP）显示LPAG^Vglut2神经元投射至下背外侧被盖核（SLD）、蓝斑（LC）和腹侧巨细胞网状核（GiV）。通过逆行示踪结合化学遗传学特异性抑制LPAG-SLD通路，发现REM睡眠减少；而光遗传学激活该通路则触发NREM-REM睡眠转换，证明LPAG-^Vglut2-SLD通路驱动REM睡眠。相反，光遗传学激活LPAG^Vglut2-LC通路或LPAG^Vglut2-GiV通路均诱导觉醒和不动状态，其中LC通路可维持长期觉醒，而GiV通路仅引起急性觉醒。该研究发表在《Cell Reports》。

**主要技术方法**
1. **c-Fos免疫组化与原位杂交**：在大鼠RSD/RSR（REM睡眠剥夺/恢复）和SD（总睡眠剥夺）模型中，检测LPAG中c-Fos与Vglut2共标神经元。
2. **光纤光度测定与光电极记录**：在Vglut2-Cre小鼠中表达GCaMP6f或ChR2，实时监测LPAG^Vglut2神经元群体钙活动及单个神经元放电。
3. **化学遗传学与光遗传学操控**：通过hM4Di/hM3Dq（化学遗传学）或ChR2（光遗传学）特异性抑制/激活LPAG^Vglut2神经元及其下游通路。
4. **多导睡眠图记录与行为学测试**：同步记录EEG/EMG，结合开放场、恐惧条件化、听觉音调等行为范式评估觉醒与不动状态。
5. **脑片电生理**：在全细胞膜片钳记录中，结合光遗传学验证LPAG^Vglut2与SLD、LC、GiV神经元的功能性突触连接。
6. **顺行与逆行示踪**：使用AAV-hrGFP（顺行）和CTb/AAV-retro-FLP（逆行）追踪LPAG^Vglut2神经元投射及REM睡眠相关通路。

**研究结果**

**1. LPAG谷氨酸能神经元在REM睡眠和觉醒期间被激活**
通过c-Fos与Vglut2共标，在RSD/RSR大鼠中，LPAG中约49%的c-Fos阳性神经元为Vglut2阳性；在SD小鼠中，该比例达58%。表明LPAG^Vglut2神经元在REM睡眠和觉醒状态被激活。

**2. LPAG^Vglut2神经元自发活动在REM睡眠和觉醒期间增强**
光纤光度测定显示，LPAG^Vglut2神经元钙活动在觉醒期最高，REM睡眠期中等，NREM睡眠期最低。光电极记录证实，opto-tagged的LPAG^Vglut2神经元在觉醒和REM睡眠期放电频率显著高于非标记神经元，且在NREM-觉醒转换前10秒放电增加。

**3. 化学遗传学抑制LPAG^Vglut2神经元减少REM睡眠**
hM4Di介导的抑制后，CNO注射小鼠REM睡眠减少35.57%，NREM睡眠增加14.12%，觉醒减少11.31%。EEG频谱显示NREM睡眠δ波和REM睡眠θ波功率增加。抑制未改变基础运动活动，但减少了恐惧条件化中的冻结行为。

**4. 化学遗传学激活LPAG^Vglut2神经元促进觉醒**
hM3Dq激活后，觉醒时间增加195.20%，NREM和REM睡眠分别减少87.07%和97.11%。觉醒期EEGθ波（6.75–10 Hz）功率增加，δ波降低。小鼠表现出不动状态（immobility），但保留对听觉和电击刺激的运动反应。

**5. 光遗传学激活LPAG^Vglut2神经元促进觉醒**
30 Hz蓝光刺激NREM睡眠中的LPAG^Vglut2神经元，即刻诱导觉醒转换，概率显著升高。连续1小时刺激维持觉醒，减少NREM和REM睡眠。EEG显示θ波增加，肌电活动降低。

**6. LPAG^Vglut2神经元投射至SLD、LC和GiV**
顺行示踪（hrGFP）发现LPAG^Vglut2神经元轴突投射至SLD、LC、GiV、LPB等区域，重点分析SLD、LC、GiV三个靶点。

**7. LPAG^Vglut2-SLD通路介导REM睡眠**
脑片电生理证实LPAG^Vglut2向SLD提供谷氨酸能输入，靶向SLD中Vglut2阳性神经元。化学遗传学抑制该通路使REM睡眠减少125.07%；光遗传学激活该通路则诱导NREM-REM睡眠转换。逆行示踪（CTb）结合c-Fos显示，RSR大鼠中LPAG-SLD通路被强烈激活。

**8. LPAG^Vglut2-LC通路诱导觉醒**
LPAG^Vglut2向LC提供谷氨酸能输入，靶向酪氨酸羟化酶（TH）阳性去甲肾上腺素能神经元。光遗传学激活LC终端（30 Hz）即刻诱导觉醒，并维持1小时。EEGθ波增加，肌电降低，促进不动状态。

**9. LPAG^Vglut2-GiV通路诱导觉醒**
LPAG^Vglut2向GiV投射，靶向Vglut2和甘氨酸阳性神经元。光遗传学激活GiV终端也诱导觉醒，但慢性刺激（1小时）不能维持长期觉醒。

**讨论与结论**
本研究表明LPAG^Vglut2神经元通过不同下游通路分别调控REM睡眠和觉醒：SLD通路驱动REM睡眠，LC和GiV通路促进觉醒和不动状态。高θ波活动与不动状态可能反映了一种警觉性静止状态，区别于冻结行为。三条通路之间具有功能分离性，多数LPAG^Vglut2神经元仅投射至单一靶区。该发现揭示了LPAG作为同时调控REM睡眠和觉醒的关键中脑区域，为睡眠障碍（如REM睡眠行为障碍、发作性睡病）提供了潜在治疗靶点。研究结论：LPAG^Vglut2环路既调控REM睡眠也调控觉醒，是参与两种状态调控的关键脑区。