三苯基磷酸酯在大鼠、人类与虹鳟鱼中的体外生物转化比较：基于米氏（Michaelis–Menten）动力学的动力学特征及通过非靶向分析解析代谢通路

《Environment & Health》：Comparative In Vitro Biotransformation of Triphenyl Phosphate in Rats, Humans, and Trout: Michaelis–Menten Kinetics and Elucidation of Metabolic Pathways via Nontarget Analysis

　　

有机磷阻燃剂（OPFRs）作为溴代阻燃剂的替代物被广泛使用，其在环境中普遍检出并引发健康关注。三苯基磷酸酯（TPhP）是其中代表性化合物，具有内分泌干扰效应。研究人员比较了0.1–10 μmol·L–1 TPhP在大鼠、人类及虹鳟鱼肝脏S9组分中的生物转化，以确定动力学参数与代谢通路。人类S9表现出最高的固有清除率（CLint），由强底物亲和力驱动；大鼠S9催化能力较高但CLint较低；虹鳟鱼生物转化显著受限，在2.5 μmol·L–1时仅消耗39.11%，呈表观零级动力学与极低反应速率，存在明显代谢瓶颈。非靶向分析揭示保守与物种特异性通路并存：水解、单羟基化及单羟基代谢物的葡萄糖醛酸化在三者中均保守；芳香双羟基化及其葡萄糖醛酸化仅存于哺乳动物，与较高细胞色素P450（CYPs）活性一致；所有物种均检出二氢二醇代谢物，提示经芳烃氧化物中间体的保守生物活化通路。该中间体解毒具物种依赖性：大鼠与虹鳟S9发生谷胱甘肽（GSH）结合，人类S9缺失此路径。结果表明TPhP生物转化具物种特异性，整合毒代动力学与代谢组学可提升新兴污染物风险评价准确性。

研究背景方面，2009年斯德哥尔摩公约限制溴代阻燃剂后，有机磷阻燃剂（OPFRs）作为替代品大量使用，其可从材料析出而广泛分布于环境介质与人体样本。TPhP具甲状腺与生殖内分泌干扰效应，但现有研究多聚焦单一酶 isoform 或靶向代谢物，缺乏跨物种整合相Ⅰ/相Ⅱ的动力学与通路比较，制约毒代动力学外推与生态风险评估。研究人员因此采用肝脏S9体外体系，系统比较大鼠、人类、虹鳟鱼对TPhP的处理差异。

本研究发表于《Environment》。研究人员以0.1–10 μmol·L^–1 TPhP为测试浓度，使用购自商业源的大鼠（50只雄性SD鼠混合池）、人类（50名供体混合性别池）、虹鳟鱼（5尾性未熟混合性别）肝脏S9组分（蛋白浓度20 mg·mL^–1），按OECD TG 319B改良方案孵育，大鼠/人孵育15 min、虹鳟鱼120 min，辅以NADPH、UDPGA、GSH辅因子。

关键技术方法包括：基于底物消耗的米氏（Michaelis–Menten）动力学拟合（Lineweaver–Burk法求K_M、V_max、CL_int）；UHPLC-HRMS非靶向分析（Orbitrap Exploris 120，正离子模式，dd-MS²）结合MZmine特征检测、PCA、火山图、Kendrick质量缺陷（KMD）分析；Schymanski置信度分级注释代谢物；以热变性S9为对照、程序空白与池化QC控污染。样本队列来源如上注明，省略试剂配制与仪器梯度细节。

研究结果部分，3.1节“Biotransformation Kinetics of TPhP in Rat-, Human-, and Trout-S9 Incubations”中，研究人员通过底物消耗曲线与双倒数作图得出：大鼠K_M=7.56±0.02 μmol·L^–1，V_max=0.98±0.17 nmol·min^–1·mg^–1蛋白，CL_int=129.25 μL·min^–1·mg^–1蛋白，呈容量驱动；人类K_M=0.61±0.10 μmol·L^–1，V_max=0.13±0.01 nmol·min^–1·mg^–1蛋白，CL_int=206.08 μL·min^–1·mg^–1蛋白，呈亲和力驱动且CL_int最高；虹鳟鱼在2.71 μmol·L^–1起始浓度下最大消耗39.11%，线性拟合r²=0.9533，按零级处理得CL_int=4.85 pmol·min^–1·mg^–1蛋白，比哺乳类低数个数量级。3.2节“NTA for TPhP Metabolites”中，PCA显示人/鱼沿PC1分离，活性与变性对照组沿PC2分时相分离；自7335特征经空白扣除、FC>3、MS²可用、质量误差<5 ppm筛选，得大鼠157、人类65、虹鳟鱼128个优先特征；KMD解析出相Ⅰ氧化/环氧化物水解产物与相Ⅱ葡萄糖醛酸（Gluc）/GSH结合物。3.2.1小节“Universal Hydrolysis of TPhP across Species”确认水解至二苯基磷酸（DPhP）为三者保守通路，支持DPhP作暴露标志物。3.2.2小节“Expanding the Phase I Metabolic Landscape of TPhP”指出单羟基TPhP（OH-TPhP，以4-OH-TPhP标准品Level 1确认）、芳香双羟基TPhP（Ar-2OH-TPhP）仅存哺乳类；首次注释乙烯基二氢二醇TPhP（vdOH-TPhP，较Ar-2OH-TPhP多2.0157 Da），提示芳烃氧化物中间体经环氧化物水解酶（EHs）开环，为保守生物活化证据。3.2.3小节“Phase II Detoxification Pathways”表明Gluc结合在三者存在（鱼无Ar-2OH-TPhP-Gluc因前体未检出），vdOH-TPhP-GSH结合见于大鼠与虹鳟鱼S9而人类缺失，与GST活性虽高但人类竞争路径（如EH）不同有关。

讨论部分研究人员强调，大鼠/人S9代谢同步性支持啮齿类作人健康推断模型，但驱动力由人亲和力导向转为大鼠容量导向，虹鳟鱼受低酶反应性限制；共享氧化代谢物（OH-TPhP、Ar-2OH-TPhP、vdOH-TPhP）指示共同活化轨迹，而相Ⅱ处理分歧显著；虹鳟鱼代谢瓶颈意味着TPhP在水生生物中生物累积潜力被哺乳动物数据高估，风险评价须用分类单元特异参数。

结论部分翻译：本研究首次综合比较大鼠、人类、虹鳟鱼TPhP毒代动力学与含相Ⅰ/相Ⅱ的生物转化通路，揭示显著种间差异。哺乳类呈底物依赖米氏动力学，虹鳟鱼呈极低速零级瓶颈；水解与单羟基化保守，芳香双羟基化及Gluc结合仅存哺乳类，vdOH-TPhP跨物种检出证伪芳烃氧化物活化保守性；相Ⅱ解毒中哺乳类偏Gluc、大鼠与鱼偏GSH。物种特异生物转化数据是准确风险建模基础，未来监管框架应整合动力学参数与代谢组轮廓以匹配目标生物代谢脆弱性。